项目八 药物的体外抗菌技术 2

药物的体外抗菌技术项目八学习目标1.熟悉药物体外抗菌试验的用途及意义2.掌握体外抗菌试验的基本方法药物的体外抗菌试验：又称药敏试验，是为了检查药物的抗菌能力，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。药敏试验抑菌试验：杀菌试验：只能抑制微生物生长，不能杀死微生物。可以杀死微生物药物的体外抗菌试验用途：

筛选抗菌药物、测定血药浓度测定抗菌谱、耐药谱、效价提取过程中的生物追踪

优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。药物的体外抗菌试验抗菌试验的影响因素1、试验菌：用专门的供应机构提供的标准菌株。北京卫生部药品生物制品检定所菌种保藏中心。试验菌应合理保藏，用前加以纯化及生物学特征鉴定。所用的试验菌株应处于对数生长期，因此期的微生物对外界因素变化最敏感。试验结果的灵敏度在一定程度上与试验菌的接种量成反比关系，故应选用适宜的接种量。抗菌试验的影响因素2、培养基抗菌试验的培养基应按试验菌的需求配制，如链球菌常用含血清的肉汤培养基，抗真菌药物试验需用沙氏培养基。培养基的酸碱度、电解质、还原性物质等均可影响试验结果，实验时应尽可能排除各种影响实验结果因素的掺入。经无菌检查合格。抗菌试验的影响因素3、抗菌药物药物的浓度、pH及含有的其他成分均可影响试验结果，特别是中草药制剂往往含有色素、杂质和鞣质等，这些均可造成错误结果，应加注意。

抗菌试验的影响因素4、对照试验：为精确判断实验结果，试验时应设各种对照，包括试验菌对照、已知药物对照及溶剂和稀释液对照等。

在实际工作中，往往可见到体外实验有作用的药物，进入机体后由于各种原因而失效，有的药物毒性很大也不能用于临床。常用的体外抑菌试验体外抑菌试验琼脂扩散法平板挖沟法纸片扩散法连续稀释法液体培养基稀释法固体培养基稀释法琼脂扩散法原理：

将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分，溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系，即抑菌圈愈大，MIC值愈小。

纸片扩散法：制成含菌平板后，将滤纸片蘸取药液置于平板上，培养后观察结果，量取抑菌圈直径以此判断试验药物抑菌作用的强弱。最常用的方法，适用于多种药物或一种药物的不同浓度对同一试验菌的抑菌试验，多用于新药的初筛及临床的药敏试验。

(二)培养基和抗菌药物纸片1．抗菌药物纸片选择直径为6.35mm，吸水量为20μl的专用药敏纸片，用逐片加样或浸泡方法使每片含药量达规定要求。含药纸片密封贮存于2℃-8℃，且不超过1周。2．培养基水解酪蛋白（M-H）培养基是兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，4℃保存。试验程序1.用接种环分别在琼脂平板上挑取形态相似的大肠杆菌菌落4～5个，接种于3～5mL肉汤管中2.35℃温箱培养2～8h，与标准比浊管比较，若菌液浓度太浓时，可用肉汤或生理盐水稀释至与0.5麦氏标准比浊管浊度相同3.在15min内，用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后涂布于M-H琼脂平板上（注意：涂布要均匀、致密），待干（三）试验步骤4.用镊子蘸取95%乙醇并通过火焰，待烧干后再蘸取乙醇重复上述操作，共三次即可达到灭菌的效果。待冷却后，用此无菌镊子夹取不同药敏纸片，按一定间隔贴在平板的不同区域，即两纸片间距不小于24mm，纸片距平板边缘不小于15mm。5.35℃温箱培养18～24h观察结果。纸片法的原理（四）结果判断和报告用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。根据NCCLS标准，作出“敏感”、“耐药”和“中介”的判断。几种抗生素抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度≤4≥8≥1513～14≤1210IU庆大霉素GEN≤0.5≥8≥2314～22≤1315IU红霉素ERY≤0.1≥2921～28≤2010IU青霉素GP-G敏感耐药敏感中介耐药相应的MIC（μg/ml）抑菌环直径（mm）纸片含药量抗生素代号（五）药物敏感试验结果解释

“敏感”（susceptible，S）：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制；“耐药”（resistant，R）：表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效。“中介”（intermediate，I）：表示测试菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使用高于正常给药量有疗效。挖沟