大鼠实验性根尖周炎病损大小及nf-表达量的变化

大鼠实验性根尖周炎病损大小及nf-表达量的变化

牙龈根尖炎通常发生在牙齿骨髓中，尤其是厌氧感染，尤其是骨关节炎。研究表明,根尖周炎骨质破坏吸收与局部炎症细胞的浸润以及多种细胞因子的产生密切相关,肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor,TNF-α)是主要的炎症因子之一,可直接诱导破骨细胞前体细胞的分化成熟,加快骨吸收,抑制骨形成,或通过RANKL/RANK/OPG系统参与破骨细胞的生物学调节。我们通过髓腔暴露法建立SD大鼠根尖周炎模型,动态观察根尖周炎病损范围以及TNF-α表达量在各炎症阶段的变化。1材料和方法1.1实验试剂与试剂8周龄雄性SD大鼠25只,体质量180～250g(南京医科大学动物实验中心);胰蛋白酶试剂盒Trypsin、TNF-α免疫组化试剂盒、DABKIT显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司);通用型二步法检测试剂盒(Ⅱ抗,中杉金桥公司)。1.2方法1.2.1球钻开髓术25只SD大鼠随机分为5组,经腹腔注射30g/L戊巴比妥钠溶液30mg/kg全麻,便携式电动牙钻机(日本)及1/4号球钻(Densply公司,瑞士)随机行单侧下颌第一磨牙近中窝开髓术,开髓深度为球钻直径并能探及穿髓点,将髓腔直接暴露于口腔环境中,另一侧同名牙作为自身空白对照。常规饲养。1.2.2麻醉大鼠造模方法分别于开髓术后1、3、7、14、21d,SD大鼠乙醚初麻后经腹腔注射30g/L戊巴比妥钠溶液50mg/kg深度麻醉后,采用4℃、4%多聚甲醛以心内灌流固定法各处死5只大鼠。分离双侧下颌骨,去净软组织,相同固定液外固定3h。1.2.3下颌组织x线片分离标本后30min内用数字化牙片机(法国艾龙赛特力,SOPIX-DC)拍摄下颌骨组织X线片(曝光条件:8mA,70kV,0.032s,焦距26.5cm)。将X线影像输入Image-ProPlus5.1生物图像处理系统(IPP5.1),描记下颌第一磨牙远中根尖周透射区面积,每个标本测量3次,取平均值。1.2.4tnf-表达下颌骨组织10%EDTA脱钙20d,含20%蔗糖的PBS溶液4℃下保存备用。修整下颌骨组织,方块截取含实验牙的后牙区牙槽骨块,液氮包埋,LeicaCM1850冰冻切片机(德国Leica公司)-25℃速冻20min,平行于远中根长轴矢状面连续切片,片厚5μm。两步法免疫组化染色测定TNF-α表达。数字摄像机(SMARTV250D德国)拍摄照片,并将照片导入IPP5.1图像分析系统,连续选取根尖孔周围共5个区域(151像素×151像素),分别测量累积光密度值(IA),每个切片测量3次,取平均值。1.3统计方法应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析处理,结果以(x¯±s)(x¯±s)表示,两样本均数比较采用方差分析和t检验。2结果2.1d根尖透射区面积图像分析结果显示,对照组大鼠远中根根尖周有一较小清晰透影区(0.1523±0.0043)mm2,即为解剖学的根尖发育区。大鼠磨牙开髓术后第3天即出现根尖破坏透射区,牙槽骨骨质有轻微破坏,边界不清晰。透射区面积从术后第3天开始至第21天逐渐增大,呈时间依赖关系,21d根尖透射区面积达到最大值。统计学分析显示,与对照组相比,3～14d根尖透射区面积都有显著增大,3～14d根尖透射区面积组间测量值均有显著性差别;其中,7-14d病变面积增加程度最显著,第21天根尖透射区面积与第14天比无显著差异(表1)。2.2tnf-阳性强度与免疫组化染色比较对照组大鼠下颌第一磨牙远中根根尖周组织可见有少量TNF-α表达,开髓术后第1天,根尖周组织中即检测到TNF-α免疫组化染色光密度值的少量增高,术后7～14d实验组根尖周病损组织中TNF-α的表达量增高,其阳性强度高于对照组(表2),且表达有一定的时间规律:术后7d时出现明显变化,随后阳性强度逐渐增大,14d达到峰值,21d时表达量降低。根尖周组织中TNF-α的表达呈现时间依赖关系(图1)。3根尖周炎中tnf-的表达牙齿根尖周炎以破骨细胞性骨吸收的增加而导致根尖周骨质丧失为特征。大鼠磨牙髓腔直接暴露法引发的根尖周炎急性炎症破坏期在1～3周。在本研究中,大鼠根尖周炎病损范围在开髓术后1～21d逐渐增高,呈时间依赖性,21d病变范围增高不显著,表明在术后21d左右,根尖炎症即开始进入相对稳定期,与上述研究的结果基本一致。TNF-α是重要的促炎症细胞因子和免疫调节因子,在根尖周炎性病变组织中主要由活化的巨噬细胞表达,TNF-α除了免疫学效应外,还具有刺激破骨细胞生成与活化,抑制成骨细胞活化和功能,促进凋亡。人类慢性根尖周炎患牙根管渗出物中可检测到TNF-α,实验性根尖周炎中可检出较多的TNF-αmRNA阳性表达细胞,这些都提示在根尖周炎骨质破坏机制中,TNF-α是一个重要的炎症性细胞因子。本研究结果显示,正常根尖周组织有少量的TNF-α稳定表达,提示TNF-α参与了根尖部正常骨组织的生理性改建过程。在炎症发生的早期(1～3d),即可检测到TNF-α表达量的增高,且在术后14d增高,并在根尖周炎症进展过程中,TNF-α的表达与根尖病损面积的变化呈相同趋势,说明根尖周组织产生炎症性骨吸收的过程中,TNF-α可能与根尖周骨质破坏进展、即破骨细胞的生成活化、破骨细胞骨吸收活性增强有密切关系,其可能机制是TNF-α促进RANKL/RANK/OPG系统诱导的破骨细胞生物学调节作用。我们其他实验资料显示,在根尖周病损组织中可见TRAP阳性、RANKL阳性细胞的增加,进一步证实了RANKL与根尖周炎骨质破坏机制的相关性。TNF-α能刺激RANKL的表达,从而介入RANKL/RANK/OPG机制,对破