加减清营汤对h2o

加减清营汤对h2o

血栓形成性脉管炎（tao）属于中医学的“脱离性”范畴。这是一种常见的周围血管疾病。其发病率位于周围血管病的第二位置，通常为年轻男性。临床以加减清营汤治疗TAO的疗效已得到证实,实验研究亦观察到该方的作用机理与改善血液流变学状态、降低全血黏度和血浆黏度、抑制血小板聚集功能、改善血液循环状态有关。为深入探讨该方治疗TAO的机制,本实验采用体外细胞培养方法,用H2O2诱导血管内皮细胞损伤模型,研究加减清营汤对内皮细胞存活率和SOD活力的影响。现将结果报道如下。1实验材料1.1药物、试剂和仪器人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304):购自中国科学院上海生物化学研究所,中国科学院典型培养物保藏委员会。加减清营汤:全方由丹参、赤芍、生地、金银花、连翘、毛冬青等组成,制成100%煎剂(即1mL/1g生药),药物由本校国医堂门诊部药房提供,符合2005版药典要求。丹参注射液:江苏神龙药业有限公司生产,批号:0506143。RPIM-1640培养粉:GIBCO,USA,批号:2535081。小牛血清:杭州四季青生物工程材料研究所,批号:040603。胰蛋白酶:Typrin,1∶250,Amerso,USA,批号:0428S05。四甲基偶氮唑盐:MTT,Bioshorp,批号:G793。二甲基亚砜:上海凌峰化学试剂有限公司,批号:050718。超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号:20041221。30%过氧化氢:H2O2,分析纯,上海久忆化学试剂有限公司,批号20060910。1.2我国上海斯克氏实验动物致死量SD雄性大鼠8只,体重(280±20)g,由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供,合格证号:SCXK(沪)2003-0003。1.3观察显微观察5%CO2培养箱(NAPCO,USA);倒置相差显微镜(Olympus,Japan);酶联免疫检测仪(BIO-RAD,USA)。2实验方法2.1正常对照组给予剂量蒸馏加减清营汤水煎剂以人临床用量×动物等效剂量比值×血清稀释度为参考浓度给给大鼠连续灌胃3天,每天2次,正常对照组给予等量蒸馏水。于末次给药后1h(灌药前禁食不禁水12h),颈动脉取血,以1000r/min离心15min,分离血清,然后56℃30min灭活以除去补体,再用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌,密封后置于-20℃冰箱保存备用。2.2分离细胞、培养细胞用传代人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)作细胞培养,按照常规方法复苏,将收获细胞用培养液悬浮后,种植于培养瓶内,置37℃5%CO2培养箱内培养2天,待细胞生长至80%融合时,用于实验。2.3清营汤药物血清培养基的制备将呈对数生长期的ECV304以105/cm2的密度接种于96孔板,分为5组,待细胞长至融合后,除正常组外,其余各组在造模前均用不含血清的培养液以增强细胞对H2O2损伤的敏感性。即:(1)正常组,含10%小牛血清的培养液;(2)模型组:加H2O2(终浓度为380μmol/L)、不含血清的培养液;(3)血清对照组:加H2O2(终浓度为380μmol/L)、含10%正常大鼠血清的培养液;(4)丹参组:加H2O2(终浓度为380μmol/L)、含10%丹参注射液(终浓度为0.5g/L)的培养液;(5)加减清营汤含药血清组:加H2O2(终浓度为380μmol/L)、含10%加减清营汤药物血清的培养液;操作完成后,置于37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱中分别培养24、36h。2.4dmso检测细胞深、dmso用量往96孔板加入5mg/mL浓度的MTT,37℃培养4h。再加入100μLDMSO震荡15min,待细胞线粒体代谢MTT所形成的甲充分溶解后,用酶联免疫检测仪按参比波长为490nm,测定各孔吸收OD值。2.5sod测量取各组细胞上清液100μL,按试剂盒方法进行操作。2.6统计学处理计量资料用均数±标准差(x¯±s)表示。应用SPSS11.0软件进行统计学处理,采用多个样本均数间比较的方差分析和两两比较的q检验。α=0.05为显著性检验水准。3各组血清中sod活性的比较见表1～2。结果显示:模型组OD值明显低于其他各组,且差别有统计学意义(P<0.01);加减清营汤含药血清组、血清对照组OD值高于丹参组,且差别有统计学意义(P<0.01);加减清营汤含药血清组在24hOD值高于血清对照组,但差别无统计学意义(P>0.05),在36hOD值高于血清对照组,且差别有统计学意义(P<0.01)。结果发现:模型组SOD活性最低,除丹参组差别无统计学意义(P>0.05)外,与其他各组均有差别,且差别有统计学意义(P<0.01);加减清营汤组SOD活性明显高于其他各组,且差别有统计学意义(P<0.01)。4氧自由基治疗血栓闭塞性脉管炎(TAO)属中医“脱疽”范畴,除了瘀血,营热、阴损也是其重要的病理因素,临床可见局部红肿破溃,痛如火灼,甚则毛发枯槁,肉腐筋烂,或局部皮肤干燥、脱屑、皲裂,汗毛脱落、稀疏或生长停止,趾(指)甲近增厚或薄脆变形、生长缓慢,肌肉萎缩,形体消瘦,舌绛脉细等表现。营热的产生除了与外界的温邪感染有关,同时也与内伤之邪化火内迫营血有关,营热的本质不单纯是温热病邪,也包括了脱疽病变过程中继发产生的某些病理因素。而血管壁的内皮细胞可认为是营阴的物质成分之一,其生理功能也是营阴的一种重要作用。近年来研究认为:氧自由基能攻击细胞生物膜中的多不饱和脂肪酸,引发自由基链式反应,形成生物膜脂质过氧化,进而形成脂质过氧化物,影响细胞的代谢及功能,甚至导致死亡。而氧自由基导致内皮细胞功能改变与TAO进展有密切关系。内皮细胞抗血栓功能的逐步减弱,是由于脂质过氧化反应的进行性加重所致,而过氧化脂质的不断堆积又为病程加重提供了病理基础,因此,提高机体氧自由基清除能力,防止脂质过氧化损伤,保护内皮细胞是临床治疗和控制TAO发展的重要手段。本研究采用MTT法和检测SOD来了解清营通脉法的代表方剂加减清营汤对内皮细胞存活率和SOD活性的影响。加减清营汤是在清代温病学家吴鞠通的清营汤的基础上结合王灿晖教授治疗脉管炎的经验组合成方,全方由丹参、赤芍、生地、丹皮、金银花、连翘、毛冬青等8味药组成,具有清营泄热解毒、活血祛瘀通脉、养阴益血敛疮等功效。研究结果发现:MTT法中用H2O2损伤细胞,细胞存活率明显下降,加减清营汤含药血清组、血清对照组OD值高于丹参组,表明效果优于丹参;加减清营汤含药血清组在24hOD值高于血清对照组,但差别无统计学意义(P>0.05),在36hOD值高于血清对照组,且差别有统计学意义(P<0.01)。说明:(1)血清对H2O2损伤的ECV304有保护作用;(2)随着时间的延长,纯粹血清的保护作用呈下降趋势,而含药血清仍保持较好的保护功能,药物的作用才显示出来。另外,加减清营汤含药血清可非常显著地提高SOD的活力,保护细胞免受自由基损伤,可能是其拮抗H2O2损伤作用的机理。现代药理研究也证实:生地有减少自由基、增加SOD、稳定细胞膜、促进VEC能量代谢、调节VEC的分泌功能等作用;赤芍、丹参的脂溶性部位对O2·-具有明显的清除作用,具有明显的抗自由基