创伤后脾细胞il-2表达受抑的机制

创伤后脾细胞il-2表达受抑的机制

伤口可能会导致身体的免疫功能紊乱，尤其是t细胞启动细胞的免疫功能抑制。白细胞介素2(IL-2)是T细胞的主要生长因子,创伤后T细胞功能受抑主要是IL-2生成不足所致。可见深入研究IL-2受抑的机制可望成为揭示创伤后T细胞功能受抑发生机制的重要突破口。目前认为,IL-2和IL-2R基因的转录是T细胞活化过程中的重要表现。现已发现,多种核转录因子是第二信使与IL-2基因转录调节之间重要的联系环节,其中NFAT的作用至关重要,对于IL-2基因的转录是必需的。目前有关创伤后NFAT的变化情况尚未见报道,因此研究创伤后核转录因子NFAT的表达及与创伤后IL-2转录表达变化之间的关系,对于阐明创伤后IL-2受抑的机制具有重要意义。1材料和方法1.1生物应益健康HEPES、DTT、PMSF、aprotinin、leupeptin、pepstainA、poly(di-dc)(宝灵曼公司);T4寡核苷酸激酶(Pharmacia)、[γ-32P]ATP(北京市亚辉生物医学工程公司);ConA(Sig-ma);3H-TdR(中国科学院上海原子能研究所);NFAT双链寡核苷酸探针:5′-CGCCAAAGAGGAAAATTTGTTTCATA-3′3′-GCGGGTTTCTCCTTTTAAACAAAGTAT-5′(SantaCruz)NFAT突变序列:5′-CGCCCAAAGCTTAAAATTTGTTTCATA-3′3′-GCGGGTTTCGAATTTTAAACAAAGTAT-5′(SantaCruz)。高速台式离心机(Beckman);紫外分光光度计(BeckmanDU-600);凝胶干燥仪(上海);垂直电泳槽、电泳仪、凝胶图像分析系统(Bio-Rad)。1.2重组质粒提取健康昆明小鼠,体重(20±2)g,建立小鼠清醒状态下双后肢闭合性砸伤+双侧股骨骨折模型。随机分为7组:正常对照、创伤后12h及1、4、7、10、14天组。按常法放眼血处死小鼠,无菌获取脾脏制备成细胞悬液,将脾细胞以RPMI1640培养液调成5×106/ml的细胞悬液,加入ConA(10μg/ml),于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h后收集培养上清以检测IL-2活性;孵育10h后收集细胞,以异硫氰酸胍-苯酚-氯仿/异戊醇法提取细胞总RNA以检测IL-2mRNA。将细胞调至1×107浓度,加入ConA(10μg/ml)活化细胞。于37℃、5%CO2孵箱中培养4h收集培养板中细胞以提取细胞核蛋白。IL-2mRNA的测定,从美国ATCC公司获得含重组质粒的大肠杆菌(37553),参照文献提取和纯化重组质粒DNA,以BamHI酶切获取小鼠IL-2cDNA1.0kb片断。cDNA的生物素标记、斑点杂交、显色及扫描测定均参照文献进行,结果以正常对照显色强度的百分比(%)表示。IL-2活性测定参照文献。细胞核蛋白提取,参照文献方法并改进如下(以下所有步骤均应在冰浴中进行):将细胞收集于离心管中离心,其沉淀重悬于适量的缓冲液A(10mmol/LHEPES,pH7.9;10mmol/LKCl;1.5mmol/LMgCl2;1mmol/LDTT;5%甘油;0.2mmol/LEDTA;1mmol/LPMSF;3mg/Laprotinin;3mg/Lleupeptin;2mg/LpepstainA;1%NP-40)中孵10min,离心(14000r/min,1min,0℃),弃上清液;沉淀重悬于适量缓冲液B(20mmol/LHEPES,pH7.9;420mmol/LNaCl;1.5mmol/LMgCl2;0.2mmol/LEDTA;0.5mmol/LDTT;25%甘油;0.5mmol/LPMSF;5mg/Laprotinin;5mg/Lleupeptin;3mg/LpepstainA)中,混匀,冰浴中置30min,离心(14000r/min,0℃,15min)。上清用适量缓冲液D(20mmol/LHEPES;100mmol/LKCl;0.2mmol/LEDTA;0.5mmol/LDTT;20%甘油;0.5mmol/LPMSF)稀释,采用考马斯兰G-250蛋白定量,分装,保存-700C。EMSA法,参照文献方法并改进如下:①探针标记:NFAT探针经变性后,在T4寡核苷酸激酶催化下,用[γ-32P]ATP标记探针5’端,经氯仿、苯酚(1∶1)抽提,乙醇沉淀,用TE溶解,-20℃保存。②核蛋白与DNA探针结合及电泳(总体积20μl):向小管中加入5×连接缓冲液4μl;poly(di-dC)1μg;BSA10μg;核提取蛋白10μg。混匀,冰浴中30min,然后加入32P-DNA探针1.5μl,室温下孵育30min。6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,干胶及放射自显影。所有数据用表示,作t检验和相关分析。2结果2.1活性、il-2基因表达对mrna的影响与正常对照小鼠相比,创伤各组小鼠IL-2活性、IL-2mRNA均有降低,二者呈非常显著的相关(r=0.77,P<0.01)。其受抑的程度在创伤后4天更为明显(附表)。2.2冷探针和突变探针反应时的选择图1示:条带1为阳性对照(Hela标准核蛋白,SantaCruz),条带2和条带3为竞争性抑制和非竞争性抑制条带(分别加入100倍浓度的冷探针和突变探针),提示本方法是特异的。2.3密度扫描结果图2为创伤后不同时相点小鼠脾细胞NFAT的DNA结合活性变化的EMSA放射自显影结果。创伤后不同时相点的电泳滞后带经图像扫描仪进行密度扫描,采用凝胶图像分析系统测定其灰度值和滞后带面积,二者的乘积表示核提取物中NFAT与标记探针结合的活性。随创伤时间延长,其DNA结合活性逐渐下降,至伤后4天时下降最明显,仅为正常对照相的41%,伤后14天时恢复(图3)。3il-2基因转录表达对于创伤后IL-2受抑的发生机制,尚缺乏合理、完善的解释。以往有关创伤后IL-2受抑发生机制的研究主要集中在:①神经-内分泌-免疫网络紊乱;②“抑制性因子”的产生;③“抑制性细胞”的出现等三个方面,但尚未形成一种完整的学说。本研究动态检测了创伤后IL-2活性和IL-2mRNA的变化,发现创伤后IL-2活性和IL-2mRNA降低,且创伤后IL-2的变化规律同IL-2mRNA相一致,二者变化关系密切。提示创伤后淋巴细胞IL-2mRNA的降低是导致IL-2产生减少的重要原因,这表明创伤后IL-2在转录水平就已受到了抑制。但IL-2基因转录降低的发生机制则远未阐明。我们发现创伤小鼠脾脏细胞及分离纯化的T细胞中IL-2的基因转录表达降低与细胞内cAMP含量升高、cGMP及三磷酸肌醇(IP3)含量减少、游离钙(Ca2+)浓度、钙调素(CaM)、CaM依赖的蛋白激酶(CaM-PK)及蛋白激酶C(PKC)活性降低均密切相关,表明创伤后淋巴细胞及活化T细胞内信使分子的改变是导致IL-2基因转录表达受抑的重要原因。而核转录因子是联系细胞内第二信使分子与IL-2基因转录的中介,活化细胞多种信号转导途径的启动是核转录因子生成的前提,而IL-2基因转录表达又有赖于核转录因子与IL-2基因启动子区域的结合。据此我们有理由推测,创伤极有可能对IL-2基因转录相关的核转录因子产生一定的影响。近年来发现参与调节IL-2基因转录的转录因子至少包括以下几种:NFAT、AP-1(ActivatorProtein-1)、kappa基因结合核因子(NF-kappaB)、八聚体结合蛋白(octamer,Oct1/2)和AP-3(ActivatorProtein-3)等。它们均可与IL-2基因启动子某些特定的序列相结合,进而高效诱导IL-2基因的转录表达。其中NFAT的作用至关重要,曾被认为是IL-2特异的转录因子,对于IL-2基因的转录是必需的。因此本研究用电泳迁移率改变试验检测了创伤后脾细