线粒体交替氧化酶呼吸途径对杂交酸模叶片光破坏的防御作用

线粒体交替氧化酶呼吸途径对杂交酸模叶片光破坏的防御作用

虽然植物用于吸收的能量来自植物，但过度光能会导致植物电子传递链中的过度还原和生态氧的产生，导致光抑制和光破坏。对于植物来说，在自然条件下，过度光的能力是不可避免的。因此，在植物进化过程中，一些植物形成了一些自我保护的方法，以减少光的抑制，如依赖黄素循环的热损失、电子传输的循环、meeher反应、叶绿体呼吸、生物氧气的酶促和非酶促腹泻系统。目前，国内外关于植物光破坏避御机制的报道主要集中在叶绿体内部的防御机制，而对叶片以外的光破坏避御机制的研究较少。研究发现,随着光强的不断增加,许多植物叶片线粒体总呼吸速率随之增加,而总呼吸速率增加主要由线粒体交替氧化酶呼吸(AOX)途径的增加引起.AOX途径是植物线粒体内除细胞色素(COX)途径之外的另一条重要的呼吸电子传递途径,广泛存在于高等植物、藻类和原生生物中.关于线粒体AOX途径的研究大部分是将AOX途径作为一条纯粹的呼吸电子传递链进行探讨,关注的焦点多放在AOX途径的产热、抗病、代谢以及活性氧的产生和消耗等方面.研究发现,AOX途径在拟南芥(Arabidopsisthaliana)等植物中具有光破坏防御作用,并将AOX途径作为叶绿体外光破坏防御的一条重要途径,但对于AOX途径光破坏防御的详细机制却尚未探明.不同光强下AOX途径在植物光破坏防御过程中是否发挥作用?AOX途径与叶绿体内其他光破坏防御途径之间有何关系?阐明这些问题对于深入理解AOX途径的光破坏防御机制,以及植物光破坏防御机制的多样性具有重要意义.杂交酸模(RumexK-1)是一种抗逆性很强的优质牧草,对低温、盐渍和高温等胁迫均有很好的抗性.本研究选用RumexK-1作为试验材料,探讨不同光强下,AOX途径对植物叶片的光破坏防御作用,以及AOX途径与叶绿体内其他光破坏防御途径之间的关系.1材料和方法1.1材料的处理与高温试验材料以RumexK-1为材料.采用盆栽,每盆1株,在温室中培养,整个生长过程按照常规栽培管理,培养期间的昼夜温度为18~22℃,中午最大光照强度为800μmol·m-2·s-1.培养4周后,取四叶一心植株的第1片完全展开叶用于试验.材料的处理按照笔者前期的方法,分别用去离子水(对照组)和1mmol·L-1水杨基羟肟酸(SHAM)溶液(处理组)恒温(25℃)黑暗处理叶圆片.将处理好的叶片分别在黑暗、弱光(200μmol·m-2·s-1)和强光(800μmol·m-2·s-1)下处理1h.使用RTE-211超级恒温水浴(NESLAB,USA)控制温度(25℃),光源为MSL1000N1(Y1)微波硫灯(友和,宁波).1.2学习方法1.2.1呼吸速率测定aol-4-m-2s-1的水平裂断法1.利用OXYTHERM氧电极(Hansatech,英国),在25℃条件下测定呼吸速率,反应室温度由OXYTHERM氧电极的控温装置自动控制.于反应杯中添加2mL磷酸缓冲液(pH6.8),加入半径0.5cm的叶圆片,在黑暗中测定叶片的耗氧速率,当耗氧速率达到稳定状态后,根据10~20min区间氧气浓度的下降斜率计算叶片总呼吸速率(Rtotal,μmolO2·m-2·s-1).总呼吸速率测定完毕后,重新在反应杯中加入1.4mL磷酸缓冲液(pH6.8)和0.6mL浓度为100mmol·L-1的SHAM溶液,加入叶圆片,在25℃条件下恒温20min,在黑暗中测定叶片的耗氧速率,当耗氧速率达到稳定状态后,根据10~20min区间氧气浓度的下降斜率计算AOX呼吸途径受抑时呼吸速率(RSHAM,μmolO2·m-2·s-1),AOX途径呼吸速率为:RAOX=Rtotal-RSHAM.根据上述方法分别测定经过不同处理之后的AOX途径呼吸速率.1.2.2光合放氧速率的测定利用Chlorolab-2液相氧电极(Hansatech,英国)测定不同光强(200和800μmol·m-2·s-1)预处理后半径为0.5cm叶圆片的光合放氧速率.反应体系为2mL1mmol·L-1的NaHCO3溶液;测定光强为800μmol·m-2·s-1,由Chlorolab-2自动控制,测定温度为25℃,由循环恒温水浴控制反应杯内温度.当放氧速率达到稳定状态后,取5~10min区间的斜率计算单位叶面积叶片光合放氧速率.1.2.3酶解环的提取NADP苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)依据文献的方法测定,NAD苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)依据文献的方法测定.25叶圆片(半径0.5cm)在3mL预冷的Hepes-KOH提取液(包含10mmol·L-1氯化镁、1mmol·L-1EDTA、5%的PVP、10%的甘油、0.05%的TritonX-100)中冰浴研磨,然后于4℃下14000×g离心5min,所获上清液为酶提取液.NADP苹果酸脱氢酶的反应液为pH8.3的Tricine-KOH缓冲液,内含150mmol·L-1氯化钾、1mmol·L-1EDTA、2mmol·L-1草酰乙酸和0.2mmol·L-1NADPH;NAD苹果酸脱氢酶的反应液为pH8.0的Bicine-KOH缓冲液,内含10mmol·L-1氯化镁、2mmol·L-1草酰乙酸和0.2mmol·L-1NADH.在一级反应范围内,以A340nm吸光值在每分钟的下降值为NADP-MDH和NAD-MDH的1个酶活单位.采用UV-2550型分光光度计(Kyoto,日本)进行比色测定.1.2.4光适应下ps的光化学特征用FMS-2型便携式脉冲调制式荧光仪(Hansatech,英国)测定叶绿素荧光参数.将光照处理后的叶圆片分别在200和800μmol·m-2·s-1的作用光下测定稳态荧光(Fs),然后启动饱和脉冲光(8000μmol·m-2·s-1),作用时间为0.7s,测定光适应下的最大荧光(Fm′).利用上述参数计算光适应条件下的PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)和光合线性电子传递速率(ETR):ΦPSⅡ=1-Fs/Fm′;ETR=ΦPSⅡ×实际光强×0.84×0.5.1.2.5叶片ojp曲线的测定采用Handy-PEA连续激发式荧光仪(Hansatech,英国)测定叶绿素a荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线).叶片经过20min暗适应后,用Handy-PEA测定叶片的OJIP曲线(测定光强为3000μmol·m-2·s-1,持续时间为2s),第1次测定完毕后,叶片暗适应10s后,进行第2次测定.根据第1次测定的OJIP曲线可以获得初始荧光值(Fo1)和最大荧光值(Fm1);根据第2次测定的OJIP曲线可以获得初始荧光值(Fo2)和最大荧光值(Fm2).根据两次OJIP曲线初始荧光的相对变化值(ΔVo)计算非还原性QB反应中心相对数量:ΔV0=[1-(1-Fo2/Fm2)/(1-Fo1/Fm1)]×100%.1.2.6超氧化物歧化酶活性测定H2O2含量依据Patterson等的方法测定;超氧化物歧化酶(SOD)活性依据Giannopolitis和Ries的方法测定;抗坏血酸氧化酶(APX)活性依据Mishra等的方法测定.1.3数据处理与统计分析采用MicrosoftExcel2003软件对数据进行处理和绘图,采用DPS软件对不同处理的测定结果进行统计分析.采用最小显著差异法(LSD,α=0.05)比较不同处理之间的差异.2结果与分析2.1u3000叶片交替呼吸速率由图1可以看出,黑暗处理后,RumexK-1叶片交替呼吸速率为0.54μmolO2·m-2·s-1,弱光处理后为0.66μmolO2·m-2·s-1,上调了23.1%,强光处理后为0.92μmolO2·m-2·s-1,上调了71.0%.经过SHAM处理后,叶片交替呼吸速率在黑暗、弱光、强光下分别下降66.1%、64.0%和62.2%.这表明不论强光还是弱光都会诱导AOX途径上调,而强光诱导AOX途径上调更明显;在强光或弱光下,1mmol·L-1SHAM溶液对AOX活性都具有明显的抑制作用.2.2sham对ros-pcr叶片中nad-mdh和nadp-mdh活性的影响依赖于NADP的苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)和依赖于NAD的苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)是将NADPH从叶绿体运输到线粒体这一过程的两种关键酶,其活性可以间接反映叶绿体内NADPH的积累情况.由图2可以看出,两种光照条件下,RumexK-1叶片中NAD-MDH和NADP-MDH活性明显高于黑暗中的活性.在黑暗条件下,与对照相比,经过SHAM处理的叶片NADP-MDH和NAD-MDH活性均无显著变化;在弱光下光照1h后,经过SHAM处理的叶片NADP-MDH和NAD-MDH活性分别下降26.39和12.69μmol·m-2·s-1;而在强光下光照1h后,其分别下降27.16和19.67μmol·m-2·s-1.随着光强的不断加强,从叶绿体输送到线粒体的NADPH不断增加,而线粒体AOX呼吸途径受抑会导致输送NADPH的关键酶活性下降,造成NADPH的运输受阻.2.3sham处理前后非还原性qb反应中心的变化由图3可以看出,在弱光或强光下处理1h后,SHAM处理的叶片实际光化学效率(ΦPSⅡ)、光合线性电子传递速率(ETR)和光合放氧速率均明显低于对照.在弱光和强光下,加入SHAM处理之后,非还原性QB反应中心分别增加75.3%和55.5%.这表明即使在弱光下,加入SHAM处理后也会加重光抑制;而在强光下,经SHAM处理后的叶片光抑制更严重.笔者前期研究表明,SHAM溶液对离体叶绿体的ΦPSⅡ和光化学猝灭(qP)等均无直接影响,即不直接影响光合活性.因此,SHAM溶液对叶片光合活性的影响是通过抑制AOX途径来起作用.2.4低温弱光对叶片抗氧化酶活性的影响由图4可以看出,强光照射1h后的叶片SOD和APX活性均大于弱光下照射1h后的活性.不论在强光还是弱光下,经过SHAM处理后的叶片SOD和APX活性均明显大于对照.强光下处理1h后,经过SHAM处理的叶片H2O2含量明显高于对照,而在弱光下处理1h后,处理组与对照的叶片H2O2含量无明显变化.这说明在弱光下,AOX途径受抑后,活性氧清除机制的上调可以清除过量产生的H2O2,避免H2O2的积累;而在强光下,AOX途径受抑后,活性氧清除酶活性的上调不足以清除过量产生的H2O2,最终导致H2O2大量积累.3关于aol和nad的活性NADP-MDH和NAD-MDH是“苹果酸-草酰乙酸穿梭”(“Malate-OAA穿梭”)系统的两个关键酶,叶绿体内的NADPH可以通过“Malate-OAA穿梭”系统转运进入线粒体.强光下NADP-MDH和NAD-MDH活性升高(图2),表明强光下叶绿体内会产生过量NADPH,并通过“Malate-OAA穿梭”系统进入线粒体,而进入线粒体的NAD(P)H则主要通过线粒体呼吸电子传递链而被消耗.线粒体呼吸电子传递链有两条途径:细胞色素途径(COX途径)和交替氧化酶途径(AOX途径).COX途径与氧化磷酸化过程偶联,是产生ATP的主要途径,其活性受ATP/ADP的限制;而AOX途径与磷酸化过程解偶联,可以绕过氧化磷酸化过程,直接消耗NAD(P)H.与黑暗条件相比,强光或弱光下的AOX途径以及NADP-MDH和NAD-MDH活性均明显升高(图1,图2),而AOX途径受抑后,NADP-MDH和NAD-MDH活性均明显下降(图2).这表明不论强光还是弱光下,AOX途径的上调对于消耗线粒体内过量的NAD(P)H,维持“Malate-OAA穿梭”系统的活性均具有重要作用.SHAM溶液被广泛用于抑制AOX途径的活性.笔者前期研究表明,SHAM溶液对离体叶绿体的ΦPSⅡ和qP无直接影响,SHAM溶液对光照处理前的叶片OJIP曲线也无影响.这说明SHAM处理不会直接影响叶片的光合机构.本试验中,SHAM处理对叶片光合机构的影响是通过抑制AOX途径起作用的.无论在强光还是弱光下,经过SHAM处理后,NADP-MDH和NAD-MDH活性均显著下降(图2),表明AOX途径受抑导致“Malate-OAA穿梭”系统受到反馈抑制,而“Malate-OAA穿梭”系统受抑势必会造成NADPH在叶绿体内过量积累以及光合电子传递链的过度还原.AOX途径受抑后,叶片的ФPSⅡ和ETR均显著下降(图3),说明NADPH在叶绿体内的过量积累以及光合电子传递链过度还原导致光合线性电子传递链受阻.无论在强光还是弱光下,SHAM处理都会导致叶片光合放氧速率下降以及非还原性QB反应中心相对数量的增加(图3),表明AOX途径受抑后均会加重光抑制.这是因为AOX途径受抑后使线性电子传递受阻(图3),过剩激发能增加,造成活性氧过量积累(图4).而活性氧的积累通过抑制D1蛋白的修复进而加重PSⅡ的光抑制.研究表明,在低pH和铝毒害的条件下,菌根和菌体SOD活性明显升高,短暂的热激会诱导APX活性上调,表明植物及真菌在逆境胁迫下会及时上调其SOD和APX活性,以清除体内的活性氧.本试验中,无论在强光还是弱光下,AOX途径受抑后,植物叶片的SOD和APX活性均显著上调