血袋细菌内毒素定量检测方法的建立

血袋保养液细菌内毒素定量检测方法的建立钟炽辉细菌内毒素的基本知识1.细菌内毒素

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌及其它微生物的细胞壁层的脂多糖，主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。内毒素能引起热原反应。2.细菌内毒素标准品

细菌内毒素国家标准品（RSE）：批号：981效价：9000EU细菌内毒素工作标准品（CSE）：以细菌内毒素国家标准品为基准标定效价3.细菌内毒素在水溶液中的状态

细菌内毒素很容易吸附在容器壁上或聚集在一起，2005版中国药典明确注明：细菌内毒素标准溶液要混旋15min并且每稀释一步要混旋30s，以充分混匀。4.鲎试剂

从海洋生物鲎的血液提取的生物试剂，只有鲎血与内毒素有特异性的凝胶反应，该试剂达到了国际标准化，全世界均采用该试剂检测细菌内毒素，尚不能采用生物合成的办法制造。5.细菌内毒素和鲎试剂生化反应原理革兰氏阴性菌死亡细菌内毒素C因子被活化为活化C因子B因子被活化为活化B因子真菌等代谢产生1，3-（β，D）-葡聚糖G因子被活化为活化G因子凝固酶原产生凝固酶凝固蛋白原产生凝固蛋白（凝胶）定性、定量检测

以上为鲎试剂的两条反应通路，可检测革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素和真菌产生的1，3-（β，D）-葡聚糖，从而间接检测革兰氏阴性菌和真菌的存在。6.细菌内毒素定量检测原理6.1光密度反应时间（t0.02）取值方法

BET系列仪器检测试管内反应物的光密度OD值，取当OD上升到0.02的点的时间作为反应时间，该点在反应曲线上的位置为浊度开始快速变化的时期，该取值能够快速、稳定的获得反应时间。

理论分析和大量试验表明，无论以哪种方法确定的反应时间，它都是内毒素含量的标志，内毒素浓度和成胶时间为负相关，即内毒素浓度越高成胶时间就越短。

实验证实，临界时间t0.02

与内毒素浓度C之间也是负相关。通过对标准品进行实验，可得C-t0.02

关系曲线，对该曲线采用最小二乘法拟合，可以求解出a0、b0的值。在对实验品进行检测时，根据实验品的临界反应时间t0.02和标准曲线方程即可求出实验品的内毒素浓度。

6.2反应速率测定法大量实验表明，内毒素浓度越高成胶时间就越快，即反应速度越快，将动力学反应曲线变换成微积分曲线，即反应速率曲线，其反应速率最大的点即是反应曲线的拐点，该点的时间作为反应时间就是浊度反应时间法中的t50，最大的反应速率也与内毒素含量相关，通过对标准品进行实验，可得C-Vmax关系曲线，对该曲线采用最小二乘法拟合，可以解出a0、b0的值。在对试验品进行检测时，把试验品的最大反应速率Vmax代入标准曲线方程，即可求出其内毒素浓度值。7.血袋保养液细菌内毒素定量检测7.1材料：鲎试剂，内毒素工作标准品，检查用水，血液保存液调节液。7.2设备：BET-32M细菌内毒素分析仪，ZH-2BLENDER

混合器。7.3标准曲线的设置7.3.1在软件里点击“使用以前标准曲线”，可在软件右方框选择曾保存过的标准曲线；7.3.2在软件里点击“做新标准曲线”，可重新制作标准曲线，具体步骤如下：（1）填好鲎试剂、内毒素、检查用水的批号；（2）分别设定好“初始浓度”（为标准曲线的最高浓度点）、“稀释梯度”（为各标准点之间的稀释倍数）、“浓度点数”（为所做标准曲线点的个数）、“平行管数”（为各点重复的管数）如下图所示：（3）点击“自动设置标准曲线”，在表格中出现所设置的数据，再点击“阴阳性对照”，选中“阴性对照”，填写平行管数，点击“试管位置选择”，点击“自动选择”，如下图所示：

（4）点击“开始检测”，程序设置完毕。新建立的标准曲线保存在“检品管理中心”的标准曲线内，新标准曲线以默认【鲎试剂批号】+【内毒素批号】+【当前时间】作为文件名存盘，也可在画面底列“保存文件名”处自行输入，如下图所示：

（5）溶解分装鲎试剂根据用量溶解鲎试剂，将溶解的鲎试剂混合在一起，分装到无热原的仪器专用检测管内，每支检测管内0.1ml。（6）加样取稀释好的内毒素系列浓度溶液，根据所设定管数分别加入有鲎试剂的小试管中，每管0.1ml，另取细菌内毒素检查用水做阴性对照。（7）检测每个浓度点在加完样后应立即用封口膜封口，放入细菌内毒素测定仪设定位置，仪器自动开始检测。待标准曲线最后一个浓度的OD值超过预设值后，用鼠