向日葵菌防细菌s-16对精细菌的抑菌效果研究

向日葵菌防细菌s-16对精细菌的抑菌效果研究

向日葵病毒是由核糖菌（lib.）引起的一种重要的全球疾病，其中最严重的国家是加拿大、美国、阿根廷和中国。该病害在中国的内蒙古、河北、山西、甘肃、新疆、陕西、宁夏及东北三省等向日葵产区普遍发生,并造成大量的经济损失。该病原可侵染向日葵的根、茎、叶、花盘等多个部位,但病害发生以茎腐型和盘腐型为主,造成植株整体或局部腐烂死亡,甚至可导致部分地区绝收,严重影响向日葵的生产。核盘菌菌核能在土壤中长期存活,在不同环境条件下,可以形成营养菌丝体,或产生有性孢子进行侵染,给菌核病的控制带来了极大的困难。在防治方面,由于向日葵菌核病的抗病育种进展缓慢,目前还没有抗病品种和高效耐病品种。化学防治主要使用的有多菌灵、速克灵和菌核净等药剂,但向日葵植株过于高大,田间用药十分困难,药剂对土壤中菌核效果有限,因此防治效果并不理想。在农业防治方面,也缺少经济实用并且效果显著的方法。从生物防治的角度,目前已经获得了大量用于核盘菌的生防菌株,但尚未得到能够应用抑制向日葵菌核病菌核形成并在我国向日葵主产区应用和推广的生防菌。本研究鉴定了1株分离自内蒙古包头市萨拉旗,能有效抑制向日葵核盘菌菌核形成的菌株S-16,并对其进行了生防效果的初步研究。以期为向日葵菌核病的综合防治探索新的手段,对将来的向日葵菌核病的生物防治研究提供材料和理论依据。1材料和方法1.1支护型学生的葵/回复突变菌的筛选生防细菌S-16分离自内蒙古包头市萨拉齐的向日葵根围土壤;参比菌株CHA-4和T-5为实验室保存的向日葵核盘菌拮抗菌;向日葵菌核病菌S.sclerotiorum(Lib.)deBary由本实验室保存;试验所用向日葵品种为美葵LD5009由北京凯福瑞农业科技发展有限公司引自美国福莱利公司(Flower)的食葵杂交种。1.2菌落生长前沿受抑制效果1.2.1对峙培养对核盘菌的作用将核盘菌菌种培养在PDA平板上,待菌落长至6cm直径,用6mm打孔器打取生长良好的菌丝块,接种于9cmPDA平板中央。在培养皿边缘用穿刺法接种菌株S-16以及其他参比菌株,25℃下培养72h后观察对核盘菌的抑制效果。并在显微镜下观察菌落生长前沿受抑制的菌丝形态。1.2.2菌株S-16发酵滤液对核盘菌的作用将菌株S-16接入50mLLB液体培养基中,25℃下150r/min培养48h。将培养液8000r/min离心10min,取上清,以孔径0.22μm过滤器过滤得到发酵滤液。按不同比例将发酵滤液混入50℃融化的PDA培养基中,以普通PDA培养基为对照。当培养基凝固后,在培养皿中心接入直径6mm的核盘菌菌饼,25℃培养。待对照组菌落直径达到6cm时,显微镜下观查菌落边缘菌丝形态。15d后观察菌核形成情况。1.3田间病斑、病斑直径和防治效果的检测1.3.1菌株S-16在离体叶片上的生防效果测定将菌株S-16接入50mLLB液体培养基中,25℃下150r/min培养48h。将菌液稀释为约2×106cfu/mL菌悬液。取生长20d的向日葵幼苗第二对真叶,浸入菌悬液中1min,取出直至无可见液滴后将直径6mm的核盘菌菌饼接于叶片表面,25℃保湿,每处理20片。以无菌水代替菌悬液为对照,重复3次。每12h测量病斑扩展直径,无症状记为0mm,计算防治效果。病斑直径计算方法:病斑直径=病斑测量直径—菌饼直径防治效果计算方法:防治效果(%)=(对照平均病斑直径—处理平均病斑直径)/对照平均病斑直径×100%1.3.2菌株S-16在向日葵幼苗上的生防效果测定采用喷雾法将1.3.1方法得到的2×106cfu/mL菌悬液喷于生长20d的幼苗表面,核盘菌接种处理及对照与1.3.1中相同,室温保湿培养,每处理20株,重复3次。每24h统计一次病情指数,计算防治效果。幼苗期向日葵菌核病分级标准:0:全株生长正常;1:仅接菌叶片表现枯萎症状;2:病斑蔓延至茎杆;3:3片以上的叶片枯萎;4:全部叶片枯萎,植株直立;5:全株坏死。病情指数计算方法:病情指数=∑(各级代表数值×各级病株数)×100防治效果计算方法:防治效果(%)=(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100%1.4s序列及系统发育树的构建1.4.1分子生物学鉴定菌株16SrDNAPCR扩增按照钟卫鸿的方法;8F和1492R通用引物序列参照Galkiewicz和Kellogg的报道,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;PCR产物测序工作由北京赛百盛基因技术有限公司完成。所测序列登录GenBank数据库,使用Blast程序进行相似性比较。从LPSN(ListofProkaryoticnameswithStandinginNomenclature)检索模式菌株,再由GenBank中得到相应16S序列,与所测得菌株S-16的16S序列一起输入MEGA4.0程序以Neighbor-Joining(进化树法)法构建系统发育树。1.4.2生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》中芽孢菌属的鉴定方法进行形态学、革兰氏染色、乙酰甲基甲醇(V.P)、接触酶、卵磷脂酶、硝酸盐还原、好氧厌氧特性的鉴定,同时使用法国生物梅里埃公司API50CHBV3.0实验条得出碳源利用生化谱,做出生理生化鉴定结果。2结果与分析2.1抑菌带周围核盘菌生长与形貌的变化2.1.1对峙培养对核盘菌的作用在菌株S-16与向日葵核盘菌对峙培养中,抑菌带宽为(8.0±2.0)mm,拮抗效果明显。靠近菌株S-16抑菌带附近的核盘菌在较大范围内不能形成菌核及菌核原基(sclerotialinitials)且菌落衰弱;而参比菌株CHA-4和T-5,无论拮抗作用强弱,抑菌带周围核盘菌气生菌丝生长繁茂且能够形成菌核与菌核原基(图1)。在显微镜下观察菌株S-16抑制的核盘菌菌丝可以发现(图2),菌丝早期在生长点附近出现丛状分支(图2B),在接近生防菌处核盘菌菌丝尖端还会出现囊泡状畸形(图2C-1)并伴有细胞壁破裂(图2C-2)的现象。2.1.2菌株S-16发酵滤液对核盘菌的作用核盘菌在混有菌株S-16发酵滤液的PDA培养基上菌落生长衰弱、缓慢且形态发生变化。核盘菌在发酵滤液浓度高于1%的固体PDA上无法形成菌核,菌落形态呈毡状,并且在40d内没有菌核形成。将受抑制(培养基发酵滤液浓度10%)而不能产生菌核的菌丝转于正常PDA培养基,菌丝正常存活并可以产生菌核(图3)。当对照组菌落直径达到6cm时,在显微镜下观察各处理菌落边缘菌丝形态。含有菌株S-16发酵滤液(浓度1%)培养基上的核盘菌菌丝(图4B)与正常菌丝(图4A)相比,表面粗糙,延伸扭曲,局部出现绞缠(图4B-1)和瘤状突起(图4B-2)。2.2植株s-16对葵核盘菌细菌的效果2.2.1菌株S-16在离体叶片上的防治效果向日葵幼苗叶片接种核盘菌12h后,对照处理的叶片上开始出现症状,而经菌株S-16菌液处理的叶片直至36h后症状才逐渐显现。48h后,对照平均病斑直径达到22.32mm,多数幼苗叶片已经完全腐烂,而此时菌株S-16菌液处理后的向日葵幼苗叶片的平均病斑直径仅为1.20mm,防效达到94.62%(表1)。说明菌株S-16能够有效控制核盘菌菌丝对叶片组织的侵染。2.2.2菌株S-16在向日葵幼苗上的防治效果菌株S-16发酵滤液和清水分别喷施在向日葵幼苗上然后接种核盘菌,结果表明,对照组从接种核盘菌24h后即可观察到病斑,72h后全部发病,120h后病情指数达到63.33。菌株S-16菌液处理组在72h有零星植株发病,直至120h病情指数仅为3.67,防病效果可达94.21%(表2)。2.3s-16的生理生化鉴定2.3.116srDNA序列分析结果菌株S-16的16SrDNA(1226bp)在GenBank进行相似性比对(登录号lcl|60155),结果表明菌株S-16与多种枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis有较高的同源性,相似率均在97%以上。其中与菌株B.subtilisstrainA23相似度最高,为98%。以MEGA4.0构建系统发育树(图5),可以看出菌株S-16与芽孢杆菌属的细菌处于一个大分支内,其中又与枯草芽孢杆菌模式菌株B.subtilisstrainDSM10遗传距离最为接近,聚类置信系数为99。2.3.2S-16的生理生化鉴定结果菌株S-16在LB固体培养基上24h的菌落形态圆形,直径约为2.5~3.0mm,奶油色,不透明;菌体成短杆状,革兰氏阳性,菌体0.8×(1.8~3.0)μm,偶见成短链,产生中生芽孢,孢囊不膨大;周生鞭毛,至少为6根;产生乙酰甲基甲醇(V.P阳性);接触酶阳性,卵磷脂酶阴性;还原硝酸盐;严格好氧;又经API50CHBV3.0鉴定得到S-16的表型谱(表3)。所得生理生化特性与《常见细菌系统鉴定手册》中枯草芽孢杆菌各项鉴定指标相符,又经APILAB软件分析,得到该菌株为枯草芽孢杆菌,ID(identification)为94.6%。结合分子鉴定和生理生化鉴定可确认菌株S-16为枯草芽孢杆菌。3菌株s-16对葵核菌核生长的影响研究表明,分离自内蒙古主产区向日葵根围土壤中的菌株S-16对核盘菌菌丝生长以及菌核形成有很强的抑制效果。对峙培养中抑菌带宽为(8.0±2.0)mm,并使抑菌带边缘菌丝形态发生变化。在菌株S-16发酵滤液浓度高于1%的培养基上,核盘菌不能形成菌核,且菌落形态衰弱并呈均匀的毡状。通过API微生物自动鉴定系统鉴定、16SrDNA序列分析和生理生化指标测定,菌株S-16为枯草芽孢杆菌B.subtilis。在以往利用生物防治手段防治菌核病的报道中,仅有少数关于生防菌抑制油菜核盘菌和丝核菌Rhizoctoniasolani菌核形成的报道。本研究筛选到的生防菌株S-16能够显著抑制向日葵核盘菌S.sclerotiorum菌核的形成,其抑制机制除了产生较强的抑菌物质外,还可以产生挥发性物质(挥发性物质的种类、结构及机制正在研究中),该物质不仅对于核盘菌的菌丝有抑制作用,更重要的是可以抑制菌核的形成,表现出防治菌核病的潜力,具有进一步研究