-淀粉酶热稳定性及失活动力学研究

-淀粉酶热稳定性及失活动力学研究

i-淀粉酶（i-1，4-葡萄糖-4-葡萄糖水解酶）是一种内切淀粉酶。根据c-1和4-葡萄糖糖的含量，随机解码-1，产生糊精和还原糖。i-淀粉酶主要来源于枯草杆菌、地衣菌、嗜热脂肪芽菌、米曲霉、黑曲霉、链霉菌、丙酮-丁醇梭菌、拟内孢酶等微生物和动植物组织。目前，ii-淀粉酶广泛应用于纺织、轻化工业、食品、造纸、医药、石油开采等领域。α-淀粉酶作为一种生物催化剂,因高温条件下半衰期短、易失活等缺点严重影响其使用效果.如用于织物前处理退浆只能低温堆置,要提高退浆率唯有延长处理时间.因此,提高酶的热稳定性,以扩大其应用领域的研究已越来越引起人们的关注.目前,提高酶热稳定性的方法有:添加稳定剂、化学修饰、固定化、蛋白质工程技术等,其中在液体酶制剂中加入热稳定剂是一种最经济有效的办法.王耀兵等人在60℃条件下加入2.5mmol/LRb+或Li+能将淀粉酶的稳定性提高1.25~1.5倍;25~50mmol/LNa+能将稳定性提高2.3倍;25~50mmol/LK+能将稳定性提高1.7倍.本文研究了醋酸钙、乳酸钠对α-淀粉酶热稳定性的影响以及热失活动力学性质.1实验1.1淀粉、碘、碘化钾材料:α-淀粉酶(科凯精细化工上海有限公司),醋酸钙、乳酸钠为化学纯,可溶性淀粉、碘、碘化钾为分析纯.仪器:超级恒温器(上海市试验仪器厂),电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂),精密增力电动搅拌器(上海硕光电子科技有限公司),UV-VIS型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),电子天平(上海精科).1.2测试方法1.2.1酶活力测定显色法测定酶活:取1mL酶液(5g/L)加入到1mL淀粉溶液(2g/L)中,在40℃恒温水浴条件下反应8min后用0.5mL盐酸溶液(1mol/L)终止反应,再加入2mL碘-碘化钾溶液(0.2%I2-2%KI),稀释至50mL,以2mL碘-碘化钾溶液和0.5mL1mol/L的盐酸溶液为空白溶液,在570nm处测定吸光度.利用标准曲线将吸光度换算成相应酶活.酶活力单位(1U)定义为:40℃时,1min内1mg酶水解的淀粉量(mg).1.2.2酶活测定法取240mL蒸馏水或热稳定剂溶液于三颈瓶中,置于恒温水浴中加热,待升到所需温度后,加入10mL酶液(5g/L),开始计时,每隔一定时间取1mL试样用显色法测定酶活.1.2.3失活速率及寿命测定热稳定剂的热稳定效果由指定温度下失活速率常数(k)、半衰期(t1/2)和活化能(Ea)的变化来表征,本文指定温度为80℃.其中失活速率常数越小,半衰期越大,活化能越大,热稳定剂的热稳定效果越好.失活速率常数(k)的测定:若为一级反应,由速率方程lnA=-kt可求得k,其中A是酶活,t是失活时间.半衰期(t1/2)的测定:指定温度下,酶活降低一半需要的时间;活化能(Ea)的测定:lnk=lnk0-(Ea/RT),其中k是失活速率常数,T是温度.2结果与讨论2.1-淀粉酶失活动力学参数由图1可观察到,未加热稳定剂的α-淀粉酶呈线性失活,lnA对失活时间t作图是一条直线,说明未加热稳定剂的酶失活符合一级反应(R2>0.99).相关的失活动力学参数如表1所示.由表1可知,α-淀粉酶在50℃时半衰期为12.0min,在70℃时失活速率常数由0.0565min-1增大到1.0820min-1,半衰期仅为1.8min,80℃时半衰期为0.4min,可知温度对此酶的半衰期影响很大.2.2不同热剂的浓度对i-iid-淀粉酶的初始酶活性和半衰期的影响2.2.1最佳浓度的确定由图2可知,随着醋酸钙浓度的提高,初始酶活和半衰期都先增后降,0.001mol/L时初始酶活最大,0.02mol/L时半衰期最大,这可能跟醋酸钙与酶形成了某种络合结构有关.80℃时0.01mol/L醋酸钙将半衰期提高到89.9min,而且初始酶活也由原来的1.25提高到1.29,所以选择0.01mol/L为最佳浓度.2.2.2乳酸钠初始酶最佳浓度的确定由图3可以看出,乳酸钠浓度为0.002mol/L时初始酶活最大,而0.02mol/L时却有最大的半衰期.80℃时0.02mol/L乳酸钠将半衰期提高到167.1min,初始酶活由原来的1.25提高到1.48,所以选择0.02mol/L为最佳浓度.2.3添加热剂后的失运动力2.3.1加入醋酸钙的最适条件加入0.001mol/L、0.01mol/L、0.02mol/L醋酸钙后淀粉酶的失活动力学如图4所示.由图4可看出,加入醋酸钙后酶的失活过程与未加热稳定剂时不同,开始时失活较快,原因是醋酸钙和酶之间的络合需要时间.随着络合物的形成,酶的失活过程符合一级反应(R2>0.98),并在这段时间内研究热稳定剂的效果,测定失活动力学参数.加入醋酸钙后α-淀粉酶的失活动力学参数如表2所示.由表2可看出,80℃下失活速率常数为0.0052min-1,半衰期还有89.9min,大大提高了α-淀粉酶的使用温度范围.由方程lnk=lnk0-(Ea/RT)可知,可利用图5中的斜率=-Ea/R求得Ea,见表3.由表3可知,加入醋酸钙后淀粉酶的热稳定性大大提高,活化能由139.88kJ/mol提高到179.43kJ/mol2.3.2乳酸钠后-淀粉酶的失活动力学加入0.01mol/L、0.02mol/L、0.06mol/L乳酸钠后淀粉酶的失活动力学如图6所示.与图4比较可知,加入乳酸钠后酶的失活动力学与醋酸钙相似.加入乳酸钠后α-淀粉酶的失活动力学参数如表4所示.由表3、表4可看出,加入乳酸钠后淀粉酶的热稳定性得到很大提高,活化能由139.88kJ/mol提高到174.43kJ/mol;70℃下失活速率常数由1.082min-1降低到0.0008min-1,半衰期由1.8min提高到470.4min在80℃条件下半衰期还有167.1min,大大提高了淀粉酶的使用温度范围.3未加热稳定剂的淀粉酶失活动力学(1)热稳定剂浓度对α-淀粉酶的影响为:随着浓度的提高,初始酶活和半衰期都先增后降,0.001mol/L醋酸钙和0.002mol/L乳酸钠时初始酶活最大,0.02mol/L醋酸钙和0.02mol/L乳酸钠时半衰期达最大.(2)未加热稳定剂的淀粉酶失活动力学符合一级反应(R2>0.99);添加热稳定剂后此酶的失活动力学发生变化,但失活中后期符合一级反应(R2>0.98),并在这段时间内研究热稳定剂的效果.(3)未加热稳定剂的淀粉酶在50℃时失活,半衰期只有12.0min,70℃失活速率常数明显增大,由0.0565min-1增大到1.0820