第12章 吸光光度法

第12章吸光光度法12.1概述12.2吸光光度法基本原理12.3分光光度计12.4显色反应及影响因素12.5光度分析法的设计12.6吸光光度法的误差12.7常用的吸光光度法12.8吸光光度法的应用吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光度法(spectrophotometry)，属于分子吸收光谱分析方法基于外层电子跃迁12.1概述吸收光谱发射光谱散射光谱分子光谱原子光谱12.2吸光光度法基本原理1吸收光谱产生的原因光:一种电磁波,波粒二象性

光谱名称波长范围X射线0.1~10nm远紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可见光400~750nm近红外光0.75~2.5um中红外光2.5~5.0um远红外光5.0~1000um微波0.1~100cm无线电波1～1000m当光子的能量与分子的

E匹配时，就会吸收光子

E=hu=hc/la跃迁类型

价电子跃迁：σ→σ*,π→π*;n→σ*,n→π*

E(h

)顺序:n→π*<π→π*<n→σ*<σ→σ*

有机化合物的生色原理b生色团（chromophore)和助色团(auxochrome)

生色团:含有π→π*跃迁的不饱和基团助色团:含非键电子的杂原子基团,如-NH2,-OH,-CH3…

与生色团相连时，会使吸收峰红移(bathochromicshift)，吸收强度增强物质的颜色吸收光颜色波长范围(l,nm)黄绿黄橙红紫红紫蓝绿蓝蓝绿紫蓝绿蓝蓝绿绿黄绿黄橙红400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-600600-650650-7502物质颜色和其吸收光关系互补色吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收的光的强度大小。

A～l关系最大吸收波长lmax：光吸收最大处的波长3一些基本名词和概念lmax对比度(Δl):有色化合物最大吸收波长(lMRmax)与试剂最大吸收波长(lRmax)之差Δl原子光谱为线光谱分子光谱为带光谱电子跃迁能级分子振动能级分子转动能级4朗伯-比尔定律光吸收定律－朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIa

T=It/I0,T:透射比或透光度

A=lg(I0/It)＝lg(1/T),A:吸光度

吸光度(absorbance)、透光率、百分透光率间的关系有：T=It/I0,T%=T×100，A=-lgT=2-lgT%朗伯定律：光吸收与溶液层厚度成正比比尔定律：光吸收与溶液浓度成正比当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系－－－朗伯比尔定律－－－光吸收定律数学表达：A＝lg(1/T)=Kbc其中，A:吸光度，T:透射比(transmitance)，K:比例常数，b:溶液厚度，c:溶液浓度注意：平行单色光均相介质无发射、散射或光化学反应摩尔吸光系数eA=e

bcA=Kbcc:mol/Le

表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液的吸光度。单位：

(L•mol-1•cm-1)c:g/LA=abca:吸光系数桑德尔(sandell)灵敏度：S当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光程内所能检测到的吸光物质的最低含量。单位：mg/cm2

S=M/e

推导：根据定义0.001＝εbc故bc＝0.001/ε（1）c为浓度，单位为mol/1000cm3,b为cm,bc表示单位截面积光程内的摩尔数，即mol/1000cm2，如果bc乘以被测物质的分子量M,则得单位截面积光程内被测物质的量，即桑德尔灵敏度S。S=（bc/1000）×M×106=bcM×103（μg·cm-2），将（1）的bc＝0.001/ε代入，S＝(0.001/ε)×M×103，得：S=M/ε灵敏度表示方法氯磺酚S测定钢中的铌50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm测定光吸收，A＝0.43,求S.(Nb原子量92.91)。有两种做法：根据A=εbC,求ε＝3.3×104L·mol-1·cm-1

吸光度的加和性A1=e1bc1A2=e2bc2A=e1bc1+e2bc2

根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及某些化学反应平衡常数的测定在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和1分光光度计的组成光源单色器样品池检测器读出系统12.3分光光度计常用光源光源波长范围(nm)适用于氢灯185~375紫外氘灯185~400紫外钨灯320~2500可见，近红外卤钨灯250~2000紫外，可见，近红外氙灯180~1000紫外、可见（荧光）能斯特灯1000~3500红外空心阴极灯特有原子光谱激光光源特有各种谱学手段单色器作用:产生单色光常用的单色器：棱镜和光栅样品池（比色皿）

厚度(光程):0.5,1,2,3,5…cm

材质：玻璃比色皿－－可见光区石英比色皿－－可见、紫外光区检测器

作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号常用检测器：光电管光电倍增管光二极管阵列光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长目视比色法—比色管光电比色法—光电比色计

光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计分光光度法与分光光度计722型分光光度计光学系统图1.光源；2.滤光片；3,8聚光镜4,7.狭缝；5.准直镜；6.光栅9.比色池；10.光电管12.4显色反应及影响因素要求：a.选择性好b.灵敏度高(ε>104)c.产物的化学组成稳定d.化学性质稳定e.反应和产物有明显的颜色差别(对比度

l>60nm)没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定－－显色反应1显色反应络合反应氧化还原反应2显色反应类型离子缔合反应成盐反应褪色反应

Zr(IV)-偶氮胂III络合物测定草酸吸附显色反应

达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色3显色剂无机显色剂:过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾有机显色剂：偶氮类：偶氮胂III三苯甲烷类三苯甲烷酸性染料铬天菁S三苯甲烷碱性染料结晶紫邻菲罗啉类：新亚铜灵肟类：丁二肟4多元络合物混配化合物Nb-5-Br-PADAP-酒石酸V-PAR-H2O离子缔合物

AuCl4--罗丹明B金属离子-配体-表面活性剂体系Mo-水杨基荧光酮-CTMAB5影响因素a溶液酸度（pH值及缓冲溶液）影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变Δl

影响待测离子的存在状态，防止沉淀

影响络合物组成形式pHλmax(nm)形式pHλmax(nm)H4L+1.2462-465Sn4+1.0530H3L4.8-5.2462,490Ga3+5.0550H2L-8.4-9.0512HL2-11.4-12.0532-538pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响b显色剂的用量稍过量，处于平台区c显色反应时间针对不同显色反应确定显色时间反应快且产物稳定；反应快但产物不稳定；反应慢，稳定需时间；反应慢但不稳定d显色反应温度加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解e溶剂f干扰离子有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率消除办法：提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态选择合适参比选择适当波长12.5光度分析法的设计1.选择显色反应2.选择显色剂3.优化显色反应条件4.选择检测波长5.选择合适的浓度6.选择参比溶液7.建立标准曲线测量条件选择1测定波长选择选择原则：“吸收最大，干扰最小”灵敏度选择性2测定浓度控制控制浓度吸光度A：0.2～0.8减少测量误差3参比溶液选择仪器调零消除吸收池壁和溶液对入射光的反射扣除干扰试剂空白：加入试剂，不加试样试样空白：加入试样，不加试剂（试样有吸收）褪色空白：试样中加入某物质，使待测组分与之作用，然后加入试剂，以此为参比。4标准曲线制作理论基础：朗伯-比尔定律相同条件下测定不同浓度标准溶液的吸光度AA～c作图12.6吸光光度法的误差非单色光引起的偏移物理化学因素：非均匀介质及化学反应吸光度测量的误差

对朗伯-比尔定律的偏移1非单色光引起的偏移复合光由l1和l2组成，对于浓度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。*其它光学方面的干扰

杂散光散射光反射光非平行光非均匀介质

胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯2物理化学因素离解、缔合、异构等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-PAR的偶氮－醌腙式化学反应显色反应体系中的副反应影响M+nL=MLn显色反应*其它离子可能与显色剂反应：M´+nL=M´Ln,消耗显色剂；*L受酸效应影响，有L-、HL+等形态存在；被测离子有络合效应。条件稳定常数：通常被测离子有99％以上络合时，可以认为反应完全，此时这个式子可以判断不同条件下显色反应的完全程度吸光度标尺刻度不均匀3吸光度测量的误差A＝0.434

，T＝36.8%时，测量的相对误差最小A=0.2~0.8,T=15~65%，相对误差<4%

dc/c=dA/A=dT/TlnTEr=dc/c×100％=dA/A×100％=dT/TlnT×100％1.示差吸光光度法目的：提高光度分析的准确度和精密度解决高(低)浓度组分(i.e.A在0.2~0.8以外)问题分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法特点：以标准溶液作空白原理：A相对=

A=bcx-bc0=bc准确度：读数标尺扩展,相对误差减少,

c0愈接近cx,准确度提高愈显著12.7常用的吸光光度法例：硫脲还原－硫氰酸盐比色法测定钢铁中的钼。酸溶，硫酸－高氯酸介质中，硫脲还原铁（III）为铁(II),除干扰，还原钼（VI）