蛋白质分离纯化与鉴定技术

蛋白质分离纯化与鉴定技术题记：上世纪七十年代，蛋白纯化一度受到冷落的现象将一去不复返了报告内容蛋白质分离纯化的常用技术手段分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策蛋白质的纯度及活性测定有关蛋白质纯化的整体思考应用举例蛋白质分离纯化的

常用技术手段发酵液预处理细胞分离细胞破碎碎片分离产品粗纯胞内产物胞外产物加热、调PH、絮凝离心、膜分离珠磨法、高压匀浆、超声法、酶解法离心、双水相萃取、膜分离盐析、层析、膜分离产品精纯层析、膜分离成品制作浓缩、干燥、无菌过滤、成型常用纯化技术从上表可以总结出，蛋白分离纯化中的常用技术如下：絮凝、膜分离、细胞破碎、双水相萃取、盐析、柱层析、离心等。絮凝技术我国工业大规模发酵一般仍采用粗料发酵（料液中含豆饼粉、玉米粉等），发酵液含大量残留培养基，造成固液分离困难。絮凝技术可较好地解决这一问题。絮凝技术：通过在发酵液中加入大分子物质（壳聚糖）和盐类，从而改变固体粒子的物理特性，使之聚合在一起形成更大的粒子而沉降，这一技术称为絮凝技术。缺点：影响因素多，不同批次的发酵液组成及发酵时间对絮凝效果均有较大影响，放大困难。前途：若使用精料发酵，则可放弃该技术。膜分离技术定义：膜分离技术是用半透膜作为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中的其它组分，从而达到分离目的的技术。它具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高和省能等优点，已作为一种单元操作而受到人们的重视。名称粒子大小分离原理粒子过滤>10um筛分原理微滤0.05—10um超滤1—1000kD受分子大小、分子构象、携带电荷等多种因素影响纳滤100—1000反渗透<100的有机物透析小分子有机物和离子电渗析离子、氨基酸渗透蒸发<100的有机物透析：它基于分子大小、分子构象与电荷、以浓度梯度为驱动力，通过水与小分子物质扩散达到分离浓缩的目的。截留分子量的确定：选择截留率在90%那点对应的分子量作为该膜的截留分子量。由于各个厂家所用的标准品不同，所以很难把不同来源的膜的截留分子量作统一比较。膜分离的优缺点优点：具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高和省能等优点。缺点：1：分辨率不高，很难把分子量很近的分子分开。一般要求两个分子的分子量相差10倍以上。2：膜污染膜污染：分离中的物质通过化学和机械作用，引起膜表面或膜孔内吸附、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过量与分离特性不可逆变化的现象。膜一旦接触待分离的物质，膜污染就已开始。膜污染现象限制了膜的推广应用。细胞破碎常用方法物理法：珠磨法、高压匀浆法和超声破碎法等。化学法：酶溶法、螯合剂法、溶剂法等。珠磨破碎细胞法利用珠磨机内大量的玻璃珠在搅拌桨的作用下通过碰撞、剪切等作用撕破或磨碎细胞以达到胞内产物释放的方法。珠磨机物料的出口处设有夹缝或筛孔板用以截留玻璃珠，从而实现连续操作。物料入口物料出口优点：处理量大，与高压匀浆法比，更容易进行温度控制。缺点：样品有一定程度的损耗，破碎程度较难控制。高压匀浆破碎细胞法利用高压破碎细胞，其原理为：从高压室（几百个大气压）压出的细胞悬液经过阀坐的中心孔道从阀坐和阀杆之间的小环隙中喷出，速度可达每秒几百米。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列的过程中经历了高速造成的剪切、碰撞、以及由高压到常压的变化，从而造成细胞的破碎。阀坐撞击环阀杆优点：处理量大、设备简单。缺点：破碎条件剧烈，易造成蛋白失活，噪音大。超声波破碎细胞法原理：通过空化作用破碎细胞。优点：设备简单，可快速处理小批量样品。缺点：不适宜处理大量样品，温度不易控制，超声产生的自由基可导致某些蛋白失活。（思考）双水相萃取萃取：利用物质在两种互不混溶的溶剂中的分配差异进行分离的技术。有机溶剂萃取：有机溶剂从水中萃取物质。反萃取：水溶液从有机溶剂中萃取物质。以上萃取的共同点是：萃取反应中的两相性质差异显著，表面张力大，易导致物质失活。双水相萃取：因两种水溶性聚合物的水溶液或一种水溶性聚合物的水溶液与盐液混合时的不相容性而形成有明显界面的两相系统。优点：萃取条件温和[两相均含有大量水（80%以上）界面张力小]；生物相容性好，有时还有稳定作用；分配系数可控（相系统组成、聚合物修饰）；易于放大（几百上千倍）。缺点：系统中较高浓度的水溶性聚合物和盐会带到产物中，去除需要辅助方法。应用举例聚乙二醇/葡聚糖系统：9%PEG4000/1.25%DEX1500,PH7.8聚乙二醇/盐系统：聚乙二醇/磷酸钾、磷酸钠、硫酸铵、硫酸钠、琥铂酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠。真核细胞表达的beta-IFN经双水相萃取，提纯了630倍。可能的应用超声上清→PEG/盐系统→疏水层析盐 析常用的为硫酸铵沉淀，实际上很多种盐对蛋白均有沉淀作用，如硫酸钠、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等。上述盐类对蛋白的沉淀能力，对系统PH值的影响均有不同，可根据实际情况进行选择。色谱—层析正相色谱反相色谱色谱柱基本理论VR1VR2W1W2W1+W22(VR2—VR1)RS=RS1.5时两个组分才能完全分开分辨率相关参数上式中N代表理论塔板数，由公式可以看出，RS随N值的增大而增大，N值增大两倍，RS增加1.41倍因此理论塔板数越高，分辨率越高。塔板理论最早由化工专家提出，认为可以将一根色谱柱看作是一根精馏柱，它由许多级蒸馏的小塔板或小短柱组成。这种假想的小塔板或小短柱越小或越短，就意味着在一个精馏塔或分离柱上允许反复进行平衡的次数就越多，即具有更高的分辨率。塔板数的计算n=5.54(VR/Wh/2)2VRWh/2VR：峰高Wh/2：1/2峰高处的峰宽由公式可知，峰越尖，n值越大，柱子的分离能力越强为便于比较，一般要给出每米柱子的理论塔板数N，我们可以由N值推算出层析柱的理论塔板高度：H=1000mm/N通过进一步的数学推导，可以得到以下公式：H=2.48dpi其中dpi代表分离介质微粒的直径，由此可看出，分离填料的颗粒越细，则每米理论塔板数越高，从而每米柱长的分辨率也越高虽然分离介质的颗粒越小，分辨率越高，但同时也造成柱子的反压增大，流速降低，同时生产成本大幅增高。根据目前的研究情况预测，填料直径的最小极限是3um左右。层析柱的分类按流动相与固定相的极性分：正相、反相按样品在固定相与流动相之间的分配情况分：线性、非线性按分离效率分，HPLC、常规柱色谱固定相样品浓度流动相样品浓度线性色谱非线性色谱线性和非线性色谱线性色谱1：样品的保留值不变2：峰形对称3：色谱峰的峰高与浓度呈线性关系非线性色谱1：样品的保留值可变2：峰形不对称3：色谱峰的峰高与浓度不呈线性关系HPLC和常规柱色谱HPLC高效体积排阻层析高效离子交换层析高效疏水层析高效反相层析高效亲和层析常规柱色谱体积排阻层析离子交换层析疏水层析亲和层析HPLC优点：分离效率高分离速度快可重复性强缺点：设备昂贵填料昂贵填料耐受酸碱的能力差与软胶相比，生物相容性差常规柱色谱优点：生物相容性好，尤其适合分离生物大分子易于装填、易于放大其配套设备，分离介质及在使用方面的理论和经验均较成熟。成本低廉缺点：柱效低，目前应用的最小颗粒为10um分离速度慢，只能承受很小的压力分离介质为软胶，在不同的PH及盐浓度下，有溶胀或收缩的现象发生，影响分离效果体积排阻层析分离原理：根据分子的流体力学半径大小进行分离。影响因素：分离介质（疏水性、荷电情况）；样品性质（疏水性、荷电情况）；缓冲液组成（表面活性剂、粘度）体积排阻层析介质的选择分子量分离范围3000-70000SepharoseSephadexSuperdex颗粒大小凝胶类型SELECTIONGUIDEBYTECHNICALOVERVIEW-GelFiltrationUsefulUsefulRec.FlowRate*FractionationRange(Mr)FractionationRange(Mr)PrepackedColumnsAverageParticleProduct(Proteins)(Dextrans)(ml/min)Size(µm)SuperdexPrepackedHR,PCandPEcolumnsSuperdexPeptide<ENDREF<FONT>100-7000(peptides)NA0.4-1.2***13Superdex75<ENDREF<FONT>3×1037×1045×102-3×1040.4-1.0***13Superdex200<ENDREF<FONT>1×104-6×1051×103-1×1050.4-1.0***13SuperdexprepgradeHiLoadprepackedcolumnsandlabpacksSuperdex30prepgrade<ENDREF<FONT>upto1×104NA0.3-1.734Superdex75prepgrade<ENDREF<FONT>3×103-7×1045×102-3×1040.3-1.734Superdex200prepgrade<ENDREF<FONT>1×104-6×1051×103-1×1050.3-1.734SuperosePrepackedHRandPCcolumnsSuperose12<ENDREF<FONT>1×103-3×105NA0.1-0.510Superose6<ENDREF<FONT>5×103-5×106NA0.1-0.513SuperoseprepgradeLabpacksSuperose12prepgrade<ENDREF<FONT>1×103-3×105upto3×1050.5***30Superose6prepgrade<ENDREF<FONT>5×103-5×106upto1×1060.3-0.5***30SephacrylHiPrepprepackedcolumnsandlabpacksSephacrylS-100HR<ENDREF<FONT>1×103-1×105NA0.1-1.050SephacrylS-200HR<ENDREF<FONT>5×103-2.5×1051×103-8×1040.1-1.050SephacrylS-300HR<ENDREF<FONT>1×104-1.5×1062×103-4×1050.1-1.050SephacrylS-400HR<ENDREF<FONT>2×104-8×1061×104-2×106NA50SephacrylS-500HR<ENDREF<FONT>NA4×104-2×107NA50SephacrylS-1000SF<ENDREF<FONT>NA5×105->108NA50UsefulUsefulApprox.Max.FractionationRange(Mr)FractionationRange(Mr)BedVolumeFlowRateParticleSizeRange,Product(Globularproteins)(Dextrans)ml/gDrySephadex(ml/min)*WetBead(µm)SephadexSephadexG-10<ENDREF<FONT>upto7×102upto7×1022-3

Darcy’slaw**

55-165SephadexG-15<ENDREF<FONT>upto1.5×103upto1.5×1032.5-3.5

60-180SephadexG-25Fine<ENDREF<FONT>1×103-5×1031×102-5×1034-6Darcy’slaw

35-140

Medium

85-260

Coarse170-520

Superfine17-70SephadexG-50Fine<ENDREF<FONT>1.5×103-3×1045×102-1×1049-11Darcy’slaw40-160

Medium100-300

Coarse200-610

Superfine20-80SephadexG-75<ENDREF<FONT>3×103-8×1041×103-5×10412-156.4

90-280

Superfine3×103-7×104NANA1.525-90SephadexLH-20<ENDREF<FONT><5×103NAdependsonsolventNA

NA*

Distilledwater,25°C.离子交换层析在适宜的载体上，例如纤维素、琼脂糖凝胶、交联的葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶以及各种合成高聚物型凝胶上，通过酯化、醚化或氧化等化学反应，引入具有酸性或碱性的离子基团，便可制备出各种类型的离子交换填料。离子交换层析的分类离子交换填料的选择离子交换类型DEAEQSP凝胶类型颗粒大小CM200-600100-30040-16020-8010-20琼脂糖含量及交联度Sepharose6B、4B、2BSepharoseCL-6B、CL-4B、CL-2BSepharoseF.F高交联度，刚性更强。随着交联度的提高，疏水性随之增强，更易发生非特异吸附，故交联度不能过分提高疏水层析疏水介质的选择配基类型高密普通凝胶类型颗粒大小影响疏