肝胰岛素抵抗细胞模型的建立与初步应用

肝胰岛素抵抗细胞模型的建立与初步应用

胰岛素抵抗是指对身体靶组织低反应能力的病理生理状态。它是一种常见的临床疾病，包括2型糖尿病、高血压、肥胖、动脉粥样硬化和其他危险因素。肝脏及外周组织是胰岛素作用的靶组织,是胰岛素耐受产生的主要部位。建立胰岛素抵抗的细胞模型,便于观察干预因素对胰岛素抵抗的直接影响,特别是更方便于筛选改善胰岛素抵抗的药物。HepG2细胞源于人的肝胚胎瘤细胞,系一种表型与肝细胞极为相似的肝胚胎瘤细胞株,在高水平的胰岛素条件下,HepG2细胞表面胰岛素受体的数目下降,下降程度与胰岛素水平及刺激持续的时间呈正相关。3T3-L1前脂肪细胞分离自Swiss小鼠的脂肪纤维细胞,能在3种诱导剂的诱导下分化成为脂肪细胞,被广泛应用于糖、脂代谢相关的基础和实验研究。因此,本实验分别采用高胰岛素诱发HepG2细胞建立肝细胞胰岛素抵抗模型和地塞米松诱发3T3-L1脂肪细胞建立脂肪细胞胰岛素抵抗模型,并将模型应用于药物筛选中。1材料表面1.1培养基和试剂地黄寡糖(Rehmanniaglutinosaoligosaccharides,ROS),其中四聚糖占60%,三糖占20%,其余为单糖或二糖,由兰州军区总医院国家中医药管理局临床中药学重点学科提供。3T3-L1小鼠前脂肪细胞购自中国医学科学院基础研究所,HepG2细胞由中国科学院兰州近代物理研究所金小东教授惠赠。地塞米松(批号123K11611)、猪胰岛素(批号024K0988)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(批号034K3734)、含酚红DMEM高糖培养基和无酚红DMEM高糖培养基(葡萄糖含量均为22.2mmol·L-1,批号分别为123K83031,074K8300)均购自Sigma公司;无酚红RPMI1640(葡萄糖含量为11.1mmol·L-1,批号1243098)培养基、胰蛋白酶(批号27250018)均购自Gibco公司;优级新生小牛血清(批号20031219)购自兰州民海生物工程有限公司;马来酸罗格列酮片购自葛兰素史克有限公司(批号05080092);葡萄糖临床检测试剂盒购自四川迈克公司(批号0406081)。人参皂苷(Ginsenoside)购自吉林宏久生物科技股份有限公司(批号041006-Z);小檗碱(Berberine)购自四川协力制药有限公司(批号050118);水苏糖(Stachyose)分别购自Sigma和北京中食科技有限公司(批号ZSK200102)。1.2培养箱、电子天平酶标仪(ThermoElectron),CO2培养箱(FormaScientific),超净工作台(北京半导体厂),倒置显微镜(OlympusIX),BP210S电子天平(赛多利斯有限公司)。2方法2.12.hepg2细胞胰岛素抵抗模型的建立2.1.1培养液培养HepG2细胞复苏后用含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液转入100ml培养瓶中,在37℃,5%CO2条件下培养。当细胞贴壁长满后,倾去培养基,用0.25%胰蛋白酶消化,每3天按1∶3比例传代1次,取对数生长期的细胞用于实验。2.1.2不同模型组细胞的胰岛素最佳浓度和最佳作用时间的确定参考文献方法进行。将处于对数生长期的细胞消化后,用含2%FBS的DMEM培养基调整细胞浓度为106·L-1,转入96孔细胞培养板中继续培养,分为空白组及模型组。待细胞单层贴壁后,空白组加入正常培养基,模型组加入新配制的含有胰岛素浓度分别为10-5、10-6、10-7、10-8mol·L-1的培养基,于37℃、5%CO2培养箱中孵育36h后,弃去培养基,先用0.01mol·L-1PBS洗涤1次,再用pH6.0的培养基37℃孵育20min。重复上述过程1次,最后用0.01mol·L-1PBS洗涤后,换上无血清的培养基,孵育24h后,用葡萄糖临床试剂盒检测培养基上清液中的葡萄糖含量。计算空白组与不同胰岛素浓度组细胞的葡萄糖消耗量差值,选择葡萄糖消耗量差值最大,即达到胰岛素抵抗最高状态的胰岛素作用浓度为胰岛素最佳浓度。确定胰岛素最佳浓度后,重复上述方法,将细胞分为空白组及模型组,空白组加入正常培养基,模型组加入新鲜配制的含有胰岛素最佳浓度的培养基,计算空白组与胰岛素作用时间分别为24、36、48和60h模型组细胞的葡萄糖消耗量差值,同样选择葡萄糖消耗量差值最大,即达到胰岛素抵抗最高状态的胰岛素作用时间为胰岛素作用的最佳时间。采用上述方法选择最佳胰岛素浓度和胰岛素作用时间,由此建立适宜的高浓度胰岛素诱发的HepG2胰岛素抵抗细胞模型。2.1.3葡萄糖临床研究采用2.1.2建立的最佳造模方法造模成功后,将空白组与模型组细胞同时置于不含胰岛素的正常培养基中继续培养24、48、72h后,用葡萄糖临床试剂盒检测培养基上清液中的葡萄糖含量。计算空白组及模型组细胞的葡萄糖消耗量。2.1.4细胞形态检测在最佳胰岛素抵抗造模条件即10-6mol·L-1胰岛素作用36h后通过HE染色观察细胞形态。取有培养细胞生长的玻片,37℃PBS漂洗培养基及杂质,4%多聚甲醛固定15min后取出晾干,常规HE染色。倒置相差显微镜观察细胞的大体形态。2.23脂肪细胞胰岛素阻力模型t3-1的建立2.2.1细胞培养参考AnilKumar分化前脂肪细胞的方法,对细胞进行分化:将3T3-L1前脂肪细胞置于含10%小牛血清的DMEM高糖培养基中,37℃、5%CO2、饱和湿度下培养。待细胞融合2d后,加含0.5mmol·L-13-异丁基-1-甲基黄嘌呤,0.25μmol·L-1地塞米松,10mg·L-1胰岛素,10%小牛血清的DMEM高糖培养基培养48h,换以含10mg·L-1胰岛素的培养基再培养48h,随后以10%小牛血清的DMEM高糖培养基继续培养,2d换培养液1次,诱导分化8～12d的3T3-L1细胞90%以上呈脂肪细胞表型可用于试验。2.2.2最佳造模时间的确定将上述分化成熟的3T3-L1脂肪细胞转入96孔细胞培养板中继续培养,分为空白组及模型组,空白组加入正常培养基,模型组加入含终浓度为1μmol·L-1地塞米松的培养基,每24h用葡萄糖临床检测试剂盒测定培养基上清液中的葡萄糖含量,计算空白组及模型组细胞的葡萄糖消耗量,得出空白组及模型组每24h的葡萄糖消耗量差值,选择葡萄糖消耗差值最大,即达到胰岛素抵抗最高状态的时间为最佳造模时间。由此确定最佳造模方法。2.2.3各组细胞葡萄糖消耗量的检测采用2.2.2建立的最佳造模方法造模成功后,将空白组与模型组细胞同时置于不含地塞米松的正常培养基中继续培养,每隔24h用葡萄糖临床检测试剂盒测定培养基上清液中的葡萄糖含量,计算空白组与模型组细胞的葡萄糖消耗量,得出空白组及模型组每24h的葡萄糖消耗量差值。2.3酮对hepg2胰岛素抵抗细胞的作用在HepG2细胞胰岛素抵抗模型建立后,进行地黄寡糖、小檗碱、人参皂苷、水苏糖、罗格列酮对HepG2胰岛素抵抗细胞模型的作用比较,药物的终浓度均为10mg·L-1,上述各组均包括加胰岛素(10nmol·L-1)处理组和不加胰岛素处理组。加药物12、24、36和48h后检测培养基上清液中的葡萄糖含量,计算模型组与给药组细胞的葡萄糖消耗量。2.43对3-l1脂肪细胞胰岛素抵抗细胞的作用在脂肪细胞胰岛素抵抗模型建立后,进行地黄寡糖、小檗碱、人参皂苷和罗格列酮对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗细胞模型的作用比较,药物的终浓度均为10mg·L-1。加药物24、48、72和96h后用葡萄糖检测试剂盒测定细胞培养基上清液中的葡萄糖含量。计算模型组与给药组细胞的葡萄糖消耗量。2.5统计处理测定的数据经SPSS11.0统计软件系统进行统计学分析,以x¯±sx¯±s表示,组间差异的显著性采用t检验。3结果3.1不同输注后细胞的葡萄糖消耗如Tab1所示,与空白组相比,胰岛素浓度由10-8mol·L-1增加到10-6mol·L-1时,模型组细胞对葡萄糖的消耗逐渐减少,10-6mol·L-1时达到最小(P<0.01),使培养基中的葡萄糖消耗量降低20.22%。如Tab2所示,在10-6mol·L-1的胰岛素作用不同时间内,随着胰岛素作用时间的延长,模型组细胞对葡萄糖的消耗均比空白组低,在36、48和60h时,模型组的葡萄糖消耗量分别降低13.16%、17.07%、30.53%,60h时两者葡萄糖消耗差值最大,差异均有显著性(P<0.01)。由此表明高浓度胰岛素诱发的HepG2细胞胰岛素抵抗模型造模最佳胰岛素作用浓度为10-6mol·L-1,产生最大程度胰岛素抵抗的胰岛素作用时间为60h。3.2各组细胞葡萄糖消耗量的比较由Tab3所示,造模成功后,将空白组与模型组细胞分别置于不含胰岛素的正常培养基中24、48、72h后,测定空白组和模型组细胞的葡萄糖消耗量,结果显示模型组细胞的葡萄糖消耗量在48h内明显低于空白组细胞(P<0.01),由此表明本方法建立的HepG2胰岛素抵抗细胞模型在48h内较为稳定。3.3hepg2细胞形态学特征在10-6mol·L-1胰岛素作用36h后,光镜下,HE染色观察可见HepG2细胞质红染,胞核蓝染。模型组细胞呈梭形或多边形,核大,核质比例失调,有时可见多核仁,胞质内有大量空泡形成,呈典型的肿瘤细胞形态学特征。模型组细胞与空白组细胞比较,均未见差别(Fig1)。3.43各组细胞葡萄糖消耗量的比较在DMEM高糖培养基中,模型组在1μmol·L-1地塞米松单独作用后,在0h～192h检测培养基上清液中的葡萄糖含量,可见模型组细胞的葡萄糖消耗量均明显低于空白组(Fig2)。其中1μmol·L-1地塞米松单独作用96h时,模型组与空白组的葡萄糖消耗量差值为最大(Fig3)。结果表明本方法建立的3T3-L1胰岛素抵抗细胞模型最佳成模时间为96h。3.53各组细胞葡萄糖消耗量的比较模型组在1μmol·L-1的地塞米松单独作用后,在0h～168h检测培养基上清液中的葡萄糖含量可见模型组细胞的葡萄糖消耗量均明显低于空白组,造模成功后将细胞置于不含地塞米松的正常培养基中,24h内模型组与空白组细胞的葡萄糖消耗量差值变化仍不明显,48h后两组的葡萄糖消耗量相同。结果表明本方法建立的3T3-L1胰岛素抵抗细胞模型在24h内较为稳定(Fig4)。3.6各组细胞胰岛素抵抗状态的比较4所示,与空白对照组比较,经过高胰岛素作用后,模型组对胰岛素的敏感性降低,细胞的葡萄糖消耗量降低(P<0.01)。加药处理12、24、36和48h后,小檗碱、水苏糖(Sigma)和水苏糖(国产)加胰岛素组与不加胰岛素组在药物处理后各时间段与模型组相比,都明显增加了细胞的葡萄糖消耗,改善了细胞的胰岛素抵抗状态,差异有显著性;人参皂苷和地黄寡糖加胰岛素组与不加胰岛素组处理12、24、48h时与模型组比较亦可明显改善模型细胞的胰岛素抵抗状态;此外罗格列酮加胰岛素处理组能够促进细胞的葡萄糖消耗,效果较单纯罗格列酮作用明显,差异有显著性。3.73药物处理前后细胞胰岛素抵抗状态的变化如Tab5所示为罗格列酮、水苏糖(Sigma)、水苏糖(国产)、小檗碱、人参皂苷与地黄寡糖对地塞米松诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗细胞模型的作用比较。与模型组相比,小檗碱加胰岛素组与不加胰岛素组在药物处理后各时间段都明显改善了细胞胰岛素抵抗状态,增加细胞的葡萄糖消耗,差异有显著性(P<0.01);水苏糖(Sigma)、水苏糖(国产)、人参皂苷和地黄寡糖不加胰岛素组在药物处理后48h即可改善胰岛素抵抗状态(均P<0.01),而罗格列酮加胰岛素处理组虽然明显改善了胰岛素抵抗,增加了葡萄糖消耗量(P<0.01),但不加胰岛素处理组与模型组比较差异未见显著性(P>0.05),说明罗格列酮只有在胰岛素的协同作用下才能更好的发挥改善胰岛素抵抗的作用。4hepg2胰岛素抵抗细胞生物学改变本实验结果表明,不同浓度胰岛素诱发HepG2细胞胰岛素抵抗模型时,以10-6mol·L-1时诱发的胰岛素抵抗模型效果最佳;同时对胰岛素作用时间的研究发现,胰岛素(10-6mol·L-1)作用36、48、60h后,HepG2细胞对葡萄糖的摄取逐渐减少,但在胰岛素作用36h后细胞活力开始下降,死亡增多。因此,综合以上情况确定高胰岛素诱发HepG2细胞胰岛素抵抗模型的最佳方案为用10-6mol·L-1的胰岛素作用HepG2细胞36h,此时HepG2细胞对葡萄糖的利用减少,即发生葡萄糖摄取和利用的障碍,说明胰岛素抵抗模型建立成功。为进一步评价HepG2胰岛素抵抗细胞模型的稳定时间,将细胞置于不含胰岛素的培养基中48h,使细胞表面的胰岛素受体数目上调,发现HepG2胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗仍明显低于对照细胞,表明HepG2胰岛素抵抗细胞模型在48h内维持对胰岛素产生抗性的特征。但超过48h细胞活力无法维持,故不再监测。HE染色未发现HepG2胰岛素抵抗细胞的特征性改变。推测HepG2胰岛素抵抗细胞的形态学改变发生在更精细的细胞结构水