生物化学与分子生物学实验：AKP的纯化及Km的测定

AKP的纯化及Km的测定——整个实验流程介绍有机溶剂法部分纯化兔肝AKPAKP比活性测定DE-52离子层析柱进一步纯化AKPAKPKm的测定有机溶剂法部分纯化兔肝ＡＫＰ1g新鲜兔肝组织倾去缓冲液剪碎、打成匀浆取6ml至于刻度离心管10ml预冷的缓冲液I6ml预冷的缓冲液I0.1ml+4.9mlPH8.8的Tris缓冲液A液离子强度低，能低渗破坏细胞膜抑制AKP的活性预冷：保持低温，因为室温下有机溶剂能使大多数蛋白质变性失活Tris维持PH恒定，保护和稳定AKP2ml正丁醇搅拌2min、静置20min过滤混匀、离心、弃上清搅拌、溶解0.5mol/L醋酸镁4ml等体积-20℃预冷丙酮滤液中的AKP不溶解，再通过离心可部分纯化AKP能使部分杂蛋白沉淀正丁醇的介电常数为17.8溶解沉淀，以降低有机溶剂的浓度0.1ml+4.9mlPH8.8的Tris缓冲液B液通过过滤，除去沉淀的杂蛋白-20℃预冷的95%乙醇，使其终浓度为30%0.5mol/L醋酸镁3ml混匀、离心（2000rpm*5min）取上清、弃沉淀混匀、离心（2500rpm*5min）弃上清、取沉淀搅拌、溶解-20℃预冷的95%乙醇，使其终浓度为60%0.2ml+3.8mlPH8.8的Tris缓冲液C液乙醇的介电常数为24.5AKP在终浓度30%的乙醇中溶解：在终浓度60%的乙醇中不溶解-20℃预冷的丙酮，使其终浓度为33%4mlPH8.8的Tris混匀、离心（2000rpm*5min）取上清、弃沉淀混匀、离心（4000rpm*5min）弃上清、取沉淀搅拌、溶解-20℃预冷的95%乙醇，使其终浓度为60%0.2ml+3.8mlPH8.8的Tris缓冲液D液丙酮的介电常数为20.7AKP在终浓度33%的丙酮溶解；在终浓度60%的丙酮中不溶解注意事项1．各步操作尽量在冰浴中进行

2．各步加入有机溶剂量必须精确3．边滴加有机溶剂边颠倒混匀，并即时离心4.分清实验过程中每次离心后保留的是上清液，还是沉淀

有机试剂差别溶解法有机溶剂沉淀法

利用不同蛋白质在有机溶剂中溶解度不同而使之分离的方法原理：a.有机溶剂降低溶液的介电常数分子间的引力与溶剂的介电常数成反比，而有机溶剂能降低溶液的介电常数，加入有机溶剂，蛋白质分子间引力增加，溶解度降低b.破坏水化膜影响因素温度控制：

大多数蛋白质遇有机溶剂很不稳定，特别是在温度较高（室温）时，极易变性失效，故操作应在0oC以下进行。有机溶剂必须先冷到-20oC~-15oC，并在搅拌下缓慢加入，沉淀析出后应尽快在低温下离心分离pH控制：

pH以接近目的酶的等电点为宜优点沉淀易于分离，过滤分辨率高有机溶剂易除去或回收适用于食品工业用酶制剂的制缺点易引起酶变性失活AKP比活性测定试剂ABCD标准管空白管PH8.8的Tris缓冲液1.01.01.01.01.01.010mmol/L底物液（ｍｌ）1.01.01.01.01.01.0各阶段稀释酶液1.01.01.01.0————标准酶液（ml）————————1.0——37℃水浴预温15min0.5mol/LNaOH0.1ml0.3%4-氨基安替比林1.0ml0.5%铁氰化钾1.0ml每加一试剂立即混匀且顺序不能颠倒DE-52离子交换层析进一步纯化AKP1.准备砂芯层析柱，流出口装乳胶管检查：少量蒸馏水冲洗，排空，关闭流出口2.装柱将DE-52倒入层析柱，自然下沉至柱底部，打开流出口放出部分液体，再数次加入DE-52至柱床体积约为1/2柱高，关闭流出口不能让柱床干掉或有气泡、分层出现3.平衡打开流出口，用缓冲液Ⅱ平衡5个柱床体积调整流速为1ml/min(约20d/min)使样品中有效成分与离子交换剂结合4.上样待缓冲液液面与层析柱顶面相平时，将样品加入顶面平整，勿扰动5.洗脱和收集待样品完全进入柱床，其液面与层析柱顶面相平，加25ml缓冲液Ⅱ洗脱25ml的40mmol/LNaCl的缓冲液Ⅱ25ml的80mmol/LNaCl的缓冲液Ⅱ25ml的120mmol/LNaCl的缓冲液Ⅱ逐步提高洗脱液中无机盐NaCl的浓度来改变离子强度，使样品组分分别洗脱而被分离35ml的200mmol/LNaCl的缓冲液Ⅱ收集层析完毕6.AKP比活性测定收集液AKP活性+蛋白质定量测定7.浓缩收集液透析袋一端折叠后夹紧封闭，将AKP活性最高的2~3管从透析袋另一端加入，加入后折叠透析袋口用夹子夹紧封闭，4℃过夜，进行浓缩第二天用ＰＥＧ１２０００继续浓缩收集液至１．５ｍｌ左右装入塑料离心管AKP酶活性测定：同前蛋白质定量测定：

考马斯亮蓝法含AKP酶活性高的收集液0.5ml+考马斯亮蓝G-502.5ml已知蛋白质浓度的标准液0.5ml

混匀，室温5min

比色1、装柱时应注意不能让柱床干掉或有气泡、分层出现，否则要重装2、实验过程中上样、洗脱、收集各步骤中均应保持流速为1mL/min3、每加入一种新的洗脱液时，要待前面的洗脱液面与柱床顶面相平时，且加入时注意柱床顶面尽量平整4、浓缩收集液时，装处理好的透析袋烧杯需用保鲜纸封口，取用时要带手套以免蛋白酶污染

注意事项ＡＫＰＫｍ测定试剂管号１２３１０ｍmol/L底物液（ｍｌ）1.0

1.0

1.0PH１０的碳酸钠缓冲液（ｍｌ）0.9

0.9

0.9蒸馏水（ｍｌ）0.1

——

——纯化ＡＫＰ（ｍｌ）——

0.1

——标准酶液（ｍｌ）——

——

0.1空白对照纯化ＡＫＰ标准ＡＫＰ37℃水浴保温１５ｍｉｎ→0.5mol/LNaOH1.0ml→0.3%4-氨基安替比林1.0ml→0.5%铁氰化钾2.0ml→放置10min→比色测定→计算应加纯化AKPml数试剂管号12345678910mmol/L底物液（ml）01.01.01.01.01.01.01.01.0蒸馏水（ml）3.07.06.05.04.03.02.02.00.0各取1.0ml于另外的9支试管中+PH10的碳酸钠缓冲液0.9ml37℃水浴预温5min+应加纯化的AKP毫升数37℃水浴保温１５ｍｉｎ+0.5mol/LNaOH1