反相高效液相色谱法同时测定人参皂苷

反相高效液相色谱法同时测定人参皂苷

1非道地人参皂苷含量测定的分析方法人参是5加科植物的干燥根（c.a.mey.）。目前已知的人参皂苷类成分有30多种,其含量分析方法有很多,其中以高效液相色谱法的应用较为普遍,但同时测定9种以上人参皂苷含量的分析方法尚未见报道。本研究建立了同时测定9种人参皂苷(Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3及Rd)含量的RP-HPLC方法,并应用该方法测定了产于吉林、辽宁的道地人参药材及产于河南、湖南、广东的非道地人参药材中相应人参皂苷的含量。结果表明,道地药材主根中9种人参皂苷总含量为1.19%～1.45%,须根为5.47%～6.90%;3个非道地药材主根分别为1.03%、1.04%和1.85%。根据这9种人参皂苷含量,分别用聚类分析和主成分分析法可鉴别人参主根与须根及药材道地性。2实验部分2.1仪器、试验设备1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司),配四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、UV检测器、ChemStation工作站控制系统;BÜCHI旋转蒸发仪(瑞士BÜCH公司);TGL-16G台式离心机(1.6×104r/min)(上海安亭科学仪器厂);METTLERAE240分析天平(瑞士MettlerToledo公司)。甲醇与乙腈为色谱纯(Merck公司),水为Mill-Q超纯水,其余试剂均为分析纯。5个产地的人参药材(吉林靖宇、吉林抚松,吉林通化、辽宁桓仁、吉林延边)由中国药品生物制品检定所收集鉴定。对照品:人参皂苷对照品Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd由吉林大学陈燕萍老师提供。2.2磷酸b的浓度色谱柱为AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mmi.d.×250mm,5μm);流动相:A.水-0.05%磷酸;B.乙腈-0.05%磷酸;B的浓度变化为:0min,18%;0～26min,18%～20%;26～35min,20%～30%;35～50min,30%～32%;50～57min,32%～33%;57～65min,33%～40%;流速1.5mL/min;柱温35℃;检测波长203nm,进样量10μL。2.3标准物质和样品溶液的制备2.3.1对照溶液的制备精密称定,取人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd适量,加甲醇制成Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd浓度分别为0.980、0.986、0.980、0.984、0.984、1.02、1.02、1.04和0.992g/L的溶液,作为含量测定时的对照溶液储备液,密封置冰箱保存。2.3.2hplc分析精密称取人参根粉末0.5g,加入水饱和正丁醇25mL浸渍过夜,超声处理30min,冷却至室温,过滤,用水饱和正丁醇25mL分5次洗涤容器和滤纸,合并滤液于茄形瓶中,回收溶剂至干,残留物用甲醇溶解并转移至5mL容量瓶,加甲醇定容,摇匀,离心后供HPLC分析。3结果与讨论3.1色谱及药材样品在拟定的色谱条件下,得到人参皂苷混合对照品色谱图(图1-A)及人参药材样品色谱图(图1-B)。由图1可知,样品中被测皂苷与相邻组分的分离度R>1.5,基本达到基线分离。3.2rb2rc,rfre甲醇分别准确移取2.3.1对照品储备液适量,由于对照品数量较多,故按浓度要求组合成4个混合对照品:(1)Rb1;(2)Rb2∶Rc=1∶1;(3)Rf∶Re∶甲醇=1∶2∶1;(4)Rg1∶Rg2∶Rb3∶Rd=1∶1∶1∶1,分别以5、10、15、20、30、35和40μL进样分析。以进样量X(μg)对色谱峰面积Y进行线性回归,结果表明,各组分在各自浓度范围内线性关系良好,回归方程、线性范围及相关系数见表1。3.3仪器精密度和标准曲线在上述色谱条件下,对同一对照品溶液进样6次,测得Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd含量的相对标准偏差(RSD)分别为0.28%、0.61%、0.32%、0.31%、0.30%、1.08%、0.29%、0.28%、1.51%,仪器精密度良好。对同一批人参药材按供试品制备方法平行提取6份,分别进样10μL,测定上述皂苷含量并计算其RSD分别为:1.54%、1.35%、1.13%、1.13%、1.39%、1.78%、1.21%、1.61%和2.69%。取供试品溶液依次在0、2、4、6、8、12、24h测定各组分的含量,RSD均小于2.00%,表明供试品溶液在室温下24h内下基本稳定。9种人参皂苷的标准曲线见表1。取已知含量的人参药材适量,精密称定,定量加入9种人参皂苷,按供试品溶液的制备方法制备,平行6份,同时制备3份空白溶液,分别进样10μL,测定并计算加样回收率和RSD,结果见表1。3.4测定人参皂苷含量按2.3.2法制备供试品溶液,在上述色谱条件下,分别进样10μL,测定不同产地人参药材中人参皂苷含量。各产地人参主根含量测定结果见表2,从而可知,道地人参药材主根中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc含量较高,而Rg2、Rb3、Rd含量相对较低,须根中人参皂苷的分析结果也与之类似。3.4.1人参皂苷的聚类分析从9个人参皂苷的总量图中可以看出,须根的人参皂苷含量明显高于主根,对36个样本以各人参皂苷的含量为特征采用欧氏距离和类平均法进行聚类分析,结果如图2所示。从图2中可见,当类间距离大于1时,36个样本可明显地被划分成两类:1～19为主根,20～36为须根,说明通过测定多种人参皂苷的含量能准确区分主根和须根。3.4.2产地中人参皂苷的含量根据5个产地36个人参样本的含量测定结果,分别将每个样本的9种人参皂苷含量求和,得到各样本的人参皂苷加和值。各产地主根和须根的人参皂苷加和值的均值与方差如图3所示。从图3中可以看出:主根中9种人参皂苷的总量为1.19%～1.45%,须根为5.47%～6.90%,不同产地的人参皂苷含量有一定差异。分别对各产地9种人参皂苷平均含量求相关系数,结果表明吉林靖宇与吉林抚松、吉林靖宇与吉林通化,吉林通化与辽宁桓仁产的人参中人参皂苷含量相关性均较好(R>0.97),其原因可能是产地间的地理位置较为接近。而吉林延边汪清县由于与其余4个产地距离均较远,故该产地人参中人参皂苷含量与其余产地相比相关系数相对较低(R<0.95)。由此可见,人参中人参皂苷含量及不同人参皂苷的比例受产地的影响,为了保证人参药材的质量,有必要对人参产地进行鉴别。3.4.3皂苷主要成分分析另从药材市场购得产于湖南、河南及广东的非道地人参主根药材,利用所建立的分析方法测定其人参皂苷含量(表2)。3个非道地药材主根中9种人参皂苷总含量分别为1.03%、1.04%和1.85%。对道地和非道地人参主根样本进行主成分分析,基于主成