《培养基的制备与消毒灭菌》 实验报告

1/1《培养基的制备与消毒灭菌》实验报告《培育基的制备与消毒灭菌》试验报告

试验目的

1.学习和把握配制培育基（以牛肉膏蛋白胨培育基的配制为例）的一般方法和原理。

2.了解消毒和灭菌的原理，把握常用灭菌方法的操作步骤。

试验原理

培育基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的养分基质，用以培育、分别、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中．微生物种类繁多，养分类型多样，加之试验和讨论的目的不同，所以培育基的种类许多。但是，不同种类的培育基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对PH要求不一样．雷菌和酵母的培育基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培育基的pH一般为中性或微碱性的(嗜碱细菌和嗜酸细菌例外)。所以配制培育基时，都要依据不同微生物的要求将培育基的pH调到合适的范围。此外，由于配制培育的各类养分物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培育基必需马上灭菌．假如来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和转变培育的酸碱度所带来不利的影响。

高压蒸气灭菌是将持灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀．连续加热，此时由于蒸气不能道出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

牛肉膏蛋白胨培育基是一种应用最广泛和最一般的细菌基础培育基，有时又称为一般培育基。由于这种培育基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的养分物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培育基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物供应碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要供应氮源和维生素，而NaCl供应无机盐。在配制固体培育基时还要加入肯定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下而垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培育基中琼脂的含量依据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。

由于这种培育基多用于培育细菌，因此要用稀酸或稀碱将其PH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

牛肉膏蛋白胨培育基的配方如下：

牛肉膏3.0g

蛋白胨10.0g

NaCl5.0g

水1000ml

pH7.4—7.6

试验仪器与药品

1.溶液或试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol／LNaOH、1mol／LHCl。

2.仪器或其他用具：试管、三角瓶、1000ml烧杯（或1000ml刻度搪瓷杯）、量筒、玻棒、培育基分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（pH5.5-9.0）、一般棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布等。

试验步骤

（一）牛肉膏蛋白胨培育基的制备

1.称量（假定配制1000ml培育基）

按培育基配方比例依次精确     地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放人水中，这时如略微加热，牛肉膏便会与称量纸分别，然后马上取出纸片。

2.溶化

在上述烧杯中先加入少于所需要的水量（如约700ml），用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积（1000ml）；假如配制固体培育基时，将称好的琼脂放人已溶的药品中，再加热溶化，最终补足所损失的水分。

3.调pH

在未调pH前，先用精密pH试纸测量培育基的原始pH，假如偏酸．用滴管向培育基中逐滴加入1mol／LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其PH，直至pH达7.4-7.6。反之，用1mol／LHCl进行调整。

4.过滤

趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些试验结果的观看。可以省去(本试验勿需过滤)。

5.分装

液体分装

分装高度以试管高度的1／4左右为宜。分装三角瓶的虽则依据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，假如是用于振荡培育用，则依据通气量的要求酌情削减；有的液体培育基在灭菌后，需要补加肯定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量肯定要精确     。

固体分装

分装试管，其装量不超过管高的1／5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。

半固体分装

一般以试管高度的1／3为宜，灭菌后垂直待凝。

6.加塞

培育基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞(或硅胶塞、金属或高温塑料试管帽等)，以阻挡外界微生物进入培育基内面造成污染，并保证有良好的通气性能(棉塞制作方法附本试验后面)。

7.包扎

加塞后，将全部试管放入铁丝筐或用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培育基名称、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时简单解开，同样用记号笔注明培育基名称、配制日期。

8.灭菌

将上述培育基以0.103MPa，l21℃，20min高压蒸气灭菌。

9.摆斜面

将灭菌的试管培育基冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜

l0.无菌检查

将灭菌培育基放入37℃的恒温箱中培育24-48h．以捡查灭菌是否彻底。

留意事项

1.蛋白胨很简单吸湿，在称取时动作要快速，另外，称量时严防药品混杂．一把牛角匙用于一种药品．或称取一种药品后，洗净——擦干——再称职另一药品——瓶盖也不要盖错。

2.在琼脂溶化过程中．应掌握火力，以免培育基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦，制培育基时，不行用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培育基中，影响细菌生长。

3.对于有些要求PH较精确的微生物，其PH的调整可用酸度计进行(使用方法、可参考有关说明书)。pH不要调过头，以避开回调而影响培育基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培育基时．若预先记好PH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培育基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。

4.分装过程中，留意不要使培育基沾在管(瓶)口上，以免沾污面塞而引起污染。

（二）高压蒸汽灭菌法步骤

1.加水

使用前在锅内加入适量的水，加水不行过少，以防将灭菌锅烧干，引起炸裂事故。加水过多有可能引起灭菌物积水。水面与三角架相平为宜

2.装料

将灭菌物品放在灭菌桶中，不要装得过满。

3.加盖

盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺旋，打开排气阀。

4.加热排气

加热后水蒸气与空气一起从排气孔排出，待锅内沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出时，排出的气流很强并有嘘声时，维持2—3min以排解冷空气。如灭菌物品较大或不易透气，应适当延长排气时间，务必使空气充分排解，然后将排气阀关闭。

5.加压

将排气阀关闭

6.保压

当压力升至0.1MPa时，温度达121℃，此时应留意观看，掌握热源。保持压力稳定，维持20-30min后，切断热源。

7.自然降压

当压力表降至“0”处，稍停，使温度连续降至100℃以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖，取出灭菌物。留意：切勿在锅内压力尚在“0”点以上，温度也在100℃以上时开启排气阀，否则会因压力突然降低，而造成培育基猛烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以后培育时引起杂菌污染。压力降到“0”时，方可打开排气阀。

8.保养

灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及内胆干燥，盖好锅盖。

9.培育基无菌检查五、关键步骤及留意事项

1.要严格按配方配制。

2.调pH不要过头。

3.干热灭菌要留意物品不要堆放过紧，留意温度的时间掌握，70?C以下放物、取物。

4.高压灭菌要留意物品不要过多，加热后排解冷空气，到时降压回零取物。

5.过滤除菌要留意