结核分枝杆菌检测及相关内容

控制结核

人人有责3月24日是第13个“世界防治结核病日”，今年卫生部的宣传主题是“控制结核、人人有责”。疾病预防控制中心提出，目前结核病仍然是严重危害人类健康的主要传染病之一，75%的病人为中青年，每年死亡13万人。结核分枝杆菌检测及相关内容张东华一、结核名称的由来

结核病是一种古老的疾病，也许有了人类不久就已有了它的存在。1973年，湖南长沙马王堆汉墓出土的2100年前的女尸身上发现左上肺门均有结核病灶。1965年，法国学者Sylvius根据解剖了死于所谓“消耗病”或“痨病”人的尸体，发现肺脏及其它器官有颗粒状的病变，根据其形态特征称之为“结核”。因而，结核的名称就此而被应用至今。二、结核病

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可以侵及很多脏器，以肺部受累形成肺结核〔pulmonarytuberculosis〕最为常见；其次有肠结核、淋巴结结核、泌尿系结核、骨结核、结核性脑膜炎、全身粟粒性结核、结核性腹膜炎等。三、我国结核病疫情现状

据2000年全国结核病流行病学抽样调查结果显示，我国结核病疫情现状为：

（1）结核病感染率高：目前全年龄组结核菌感染率为44.5%，全国约5.5亿人受到了结核菌感染，结核菌感染率高于全球人口感染率为1/3的水平。

（2）结核病患病率高：全国活动性肺结核患病率为367/10万，涂阳肺结核患病率为122/10万，菌阳肺结核患病率为160/10万；估算全国现有活动性肺结核病人数450万，其中涂阳肺结核病人150万，菌阳肺结核病人200万。

（3）结核病耐药率高：肺结核病人结核菌初始耐药率为18.6/10万,继发耐药率为46.5/10万。按照全国菌阳肺结核病人200万计算，全国有耐药病人55.5万。

（4）结核病死亡率高：全国结核病死亡专率为9.8/10万,每年因结核病死亡13万人，为各种其他传染病和寄生虫病死亡总和的2倍。四、肺结核的主要症状肺结核是由结核杆菌引起的一种慢性肺部感染性疾病。病初有轻微咳嗽或咯痰，或有四肢结节性红斑。部分病人表现为胸痛、咯血。常见的全身症状有周身不适，精神萎靡，易倦乏力，性情烦躁，心悸，食欲减退，体重减轻，盗汗，不规则低热，两颧潮红，妇女月经不调。也有无明显症状，仅在胸部X线健康检查时才被发现。在慢性病程中，病情恶化，可有高热畏寒，紫绀气促，肺萎缩，肺气肿，渗出性胸膜炎，胸膜增厚等。本病的病因与结核杆菌感染因素有关。本病主要诊断依据结合局部和全身症状。痰液检查找到结核杆菌可确诊。

五、结核分枝杆菌检测方法（一）涂片检查（二）分离培养（三）动物试验（四）基因诊断结核分枝杆菌检验程序（一）标本的收集及直接涂片法1.痰标本最好为清晨第一口痰，洁净水或冷开水漱口后，用力咳嗽以获得2-3ml痰液置于标本盒内，直接涂2.0cm×2.5cm的卵圆形痰膜，自然干燥后抗酸染色镜检即可。涂片应使用干净无划痕的新玻片。痰标本不能使用蜡盒，因为其可导致涂片结果假阳性。

2.尿液留取12小时尿液，静置，倾去上清，留取沉淀部分30ml，以3000r/min离心30min，弃上清，取沉淀物涂片.3.脑脊液无菌收集脑脊液，放置24小时后，取网膜状蛋白质涂片，或以3000r/min离心30min，取沉淀物涂片。4.胸腹水与尿液同。5.胃液标本将标本置冰箱内20分钟，取浓厚部分进行涂片。6.病灶组织：先用组织磨碎器磨碎后，同痰标本涂法。（二）集菌涂片法取深咳痰10ml于消毒处理过的广口瓶中，加5倍量的无菌蒸馏水，经121℃高压蒸汽灭菌20min，待用。离心集菌法：取上述痰液10ml放入50ml离心管内加蒸馏水至50ml，3000r/min离心30min，取沉淀物涂片。漂浮集菌法：取上述痰液10ml放入100ml细口玻璃容器内，加蒸馏水30ml，加入二甲苯0.3ml，振荡10min，加蒸馏水至满，静置15min，取载玻片盖于瓶口，静置15min，取下玻片，干后染色。目前我们实验室采用BaSO溶痰剂与痰检体2：1或3：1混合均匀，静置10~20min，待其完全溶化，离心取沉淀涂片染色。简化了操作过程。（三）染色方法

1.抗酸染色第一液：碱性复红乙醇溶液10ml5％石炭酸溶液90ml

第二液：浓盐酸3ml95％乙醇97ml

第三液：美蓝乙醇饱和溶液100ml10％KOH0.1ml

蒸馏水100ml

染色步骤：⑴涂片经火焰固定后加第一液约5min，水洗。⑵第二液脱色，至涂片无红色脱出为止，水洗。⑶第三液复染约30s，水洗，自然干燥后镜检。结果：抗酸杆菌呈红色，背景为蓝色。报告方式；﹙

﹚未发现抗酸菌/300个油镜视野

(±)1～

2个抗酸菌/300个油镜视野

(1+)3～9个抗酸菌/100个油镜视野

(2+)10～99个抗酸菌/100个油镜视野

(3+)1～10个抗酸菌/每个油镜视野

(4+)＞10个抗酸菌/每个油镜视野2.荧光染色法（金胺O法）（1）染色剂：金胺0.01g溶于95％乙醇

10ml内，加5％

石炭酸至100ml。

脱色剂：3％

盐酸乙醇。

复染剂：0.5％

高锰酸钾水溶液。（2）染色步骤：痰涂片火焰固定，加染色剂，10~15分钟水洗。脱色剂脱色3~5分钟，至无黄色，水洗。复染剂染2分钟，水洗，干后用荧光显微镜镜检。

（3）结果：结核分枝杆菌呈金黄色荧光。如下图。（二）分离培养结核分枝杆菌培养一般使用罗-琴培养基、米氏TH10培养基、L-J培养基或T2H培养基。生长缓慢，用罗-琴培养基培养2~6W方可见到菌落。菌落多为粗糙型，不透明，乳白色或米黄色，呈干燥颗粒状，形似菜花。生物学特性：结核分枝杆菌是分枝杆菌属内对人类及动物致病的主要病原菌。典型的结核分枝杆菌的形态为细长稍弯曲或直的，两端圆钝的杆菌，长1～4微米，宽0.3～0.6微米，单个散在，有时呈X、Y形或条索状。痰标本涂片经过抗酸染色后在100倍的生物显微镜下可以看到。结核分枝杆菌生长缓慢，为寻找一种快速、简便、成本低廉的培养方法，Vasauthor等用含椰子汁和马血清的培养基使培养时间缩短至6d。也有人采用以新鲜椰子水、人血浆、甘油等混合组成的液体培养基(简称CPG)建立一种快速、简单、廉价、可靠的结核分枝杆菌培养方法。CPG阳性平均时间9d。另外，美国BD公司开发的BACTECTMMGITTM960分枝杆菌培养/鉴定/药敏系统，阳性标本检出时间：是目前全球最快的分枝杆菌培养、鉴定、药敏系统。分枝杆菌快速培养阳性标本检出时间平均为9天；鉴定、药敏试验时间平均为4天。系统功能：具备分枝杆菌快速培养、药敏、鉴定试验三项功能配套。药敏试剂：可提供配套异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素四种药物抑菌浓度、杀菌浓度药敏试验。标本范围：包括痰、胸腹水、体液、脑脊水、体液、脑脊液、组织块状标本及其它非血液标本。什么情况下应对病人进行痰结核菌培养？

尽管痰结核菌培养不是作为传染源诊断的主要方法，但结果可信度高，并能做结核菌药敏试验。所以当病人痰涂片检查阴性，需要进一步进行鉴别诊断时，如果痰培养阳性能确诊为肺结核病人。还有一些病人经抗结核药物治疗失败需要进行结核菌的菌型鉴定和药敏性试验时也必须进行痰培养。目前痰培养有许多方法，传统的改良罗氏培养基培养方法需要4-8周才能报告结果。目前像Bactec等快速培养法可使时间缩短至5-7天报告结果，也可作药敏试验。关于新鲜和陈旧标本中结核分枝杆菌检测方法的探讨

为了选择一种方便的检测方法，有人采用了抗酸染色、细菌培养、荧光染色、聚合酶联反应（PCR）4种方法分别检测陈旧标本和新鲜标本中结核分枝杆菌，结果如下：新鲜标本抗酸染色、细菌培养、荧光染色、PCR4种方法阳性率分别为30.6%、36.6%、48.2%、50%;陈旧标本分别为24.8%、31.8%、45.7%和0。结果显示，PCR检测新鲜标本中的MTB敏感性最高，与抗酸染色比较，差异有显著性（P<0.05），但不能检测陈旧标本中的MTB。可能是PCR扩增技术需要标本的脱氧核糖核酸有较高活动性，荧光染色在新旧两种标本中均有较高敏感性。总之，新鲜标本可用于抗酸染色和细菌培养检测，但敏感性低。荧光染色对新旧标本检测均可获可靠结果，可能是由于荧光素稳定，发光使信号放大，在荧光显微镜下更容易观察。PCR对新鲜标本敏感性高，但对放置过久的标本不能发挥作用，因此应尽快处理采集的标本，方可获得可靠结果。六、结核分枝杆菌的抵抗力与消毒

结核分枝杆菌和普通细菌比较，对物理和化学的消毒与灭菌方法具有比较强的抵抗力。因此，有些消毒剂对普通细菌有比较强的杀菌效果，而对结核分枝杆菌的消毒效果比较差或无消毒作用。结核分枝杆菌常用的物理消毒方法

（1）煮沸消毒：一般含有结核杆菌的物品，应该持续煮沸10分钟以上才能杀死全部的结核分枝杆菌，达到完全灭菌的效果。所以，患者在家中的痰纸、废纸、痰均可采用火烧消毒。

（2）高压蒸气灭菌：是普遍应用的灭菌效果最好的消毒方法；在121.3℃（1.05kg/cm2）持续30分钟的消毒处理是结核分枝杆菌及其污染物的最安全最彻底的消毒灭菌方法。

（3）紫外线消毒：结核分枝杆菌对紫外线具敏感性。主要指日光内的紫外线和紫外线灭菌灯。痰标本涂片在直射的太阳光下照射2～7小时，可以杀死结核分枝杆菌，对结核患者的衣物、被褥等用品，采用太阳光照射的简单消毒法是有效的。尤其是在晴朗的夏天，经过太阳3～4小时的照射，可以完全达到消毒效