BSA毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用课件

BSA毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用02化工专业：伍品端指导老师：马志玲副教授BSA毛细管电色谱柱的制备及手性分离应用1目录Ⅰ.研究意义和研究现状Ⅱ.实验部分Ⅲ.结果与讨论Ⅳ.实验创新点目录Ⅰ.研究意义和研究现状2Ⅰ.研究意义和研究现状手性分离的重要性

生物大分子几乎都具有“手性”特征。手性药物各对映体的药效学等可能存在很大的差异。

因而评价手性药物各对映体的生物学活性,建立快速、准确、灵敏的对映体拆分方法具有十分重要的意义。

Ⅰ.研究意义和研究现状手性分离的重要性3

拆分对映体的色谱技术：高效液相色谱高效毛细管电泳超临界流体色谱

……

毛细管区带电泳胶束电动色谱毛细管电色谱（CEC）(以电渗流为驱动力的微柱液相色谱技术)……对映体分离机理：

手性选择剂与对映体主要为疏水和静电作用

，只有具备特定空间构形和化学官能团的分子才能与这一区域结合。Ⅰ.研究意义和研究现状

拆分对映体的色谱技术：毛细管区带电泳对映体分离机理：4CEC的优点：CELCCEC高效性高选择性多功能性高效性、高选择性、多功能性Ⅰ.研究意义和研究现状CEC的优点：CELCCEC高效性高选择性多功能性高效性、高5常用CEC手性选择剂人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素蛋白、卵类粘蛋白、α-酸性糖蛋白

等。手性引入方法柱前手性衍生化法手性流动相添加剂法

手性固定相法

Ⅰ.研究意义和研究现状√常用CEC手性选择剂手性引入方法Ⅰ.研究意义和研究现状√6

总之，CEC以样品与固定相之间的相互作用为分离机理，以电渗流为流动相驱动力。不仅具有CE水平的高柱效，而且具有HPLC水平的高选择性。而且，CEC整体柱在手性分离中也显示出一定优势。Ⅰ.研究意义和研究现状返回总之，CEC以样品与固定相之间的相互作用为分离7Ⅱ.实验部分毛细管处理在毛细管内聚合整体柱基质用动态法在聚合整体柱基质上键合BSA蛋白使用选择性键合蛋白质对手性物质进行分离1.仪器和试剂（略）2.实验方法Ⅱ.实验部分毛细管处理在毛细管内聚合整体柱基质用动态法在聚合8二、在毛细管内合成整体柱

返回单体交联剂二、在毛细管内合成整体柱

返回单体交联剂9三、键合BSA蛋白

Epoxymethod返回三、键合BSA蛋白

Epoxymethod返回10四、使用选择性键合蛋白质对手性物质进行分离。返回分离对象：D,L－组氨酸分离条件：运行缓冲溶液：2mM磷酸盐缓冲液分离电压：＋6kV检测方法：

电导检测四、使用选择性键合蛋白质对手性物质进行分离。返回分离对象：D11Ⅲ.实验结果与讨论一、整体柱基质聚合条件的优化二、整体柱分离D,L-组氨酸对映体Ⅲ.实验结果与讨论一、整体柱基质聚合条件的优化12活性基团——IR渗透性——背压孔结构——SEM、氮吸附法整体柱基质聚合条件的优化表1整体柱各性能的影响因素最佳聚合条件

单体含量交联剂含量致孔剂含量活性基团√渗透性√√孔结构

√活性基团——IR整体柱基质聚合条件的优化表1整体柱各13环氧活性基团——IR

环氧基和酯基分别在约910cm-1和1730cm-1处有吸收。图1整体柱基质的红外光谱图环氧活性基团——IR环氧基和酯基分别在约9114单体含量对整体柱活性基团含量的影响

固定致孔剂和溶剂的含量，改变单体（）和交联剂（）相对含量，用红外光谱法比较环氧基吸收峰（约910cm-1）和酯基吸收峰（约1729cm-1）峰面积。返回

样品号单体/交联剂环氧基峰面积酯基峰面积环氧基与酯基峰面积之比1＃3：233.405559.39040.56252＃1：126.807249.15960.54533＃2：326.324553.51840.4919表2环氧基与酯基峰面积比较单体含量对整体柱活性基团含量的影响固定致孔剂和151.交联剂含量对整体柱背压的影响原因：随着交联剂用量的减少，相分离提前，使孔径增大。样品号

单体/交联剂（v/v)流速（mL/min)背压（MPa）C3#3:20.0053.4C6#1:10.0054.7C7#2:30.005>5.2表3不同交联剂含量的整体柱基质背压1.交联剂含量对整体柱背压的影响原因：随着交联剂用量的减少，162.致孔剂含量对整体柱背压的影响随着致孔剂（非良性溶剂）用量增大，相分离提前，孔径增大。返回图2不同致孔剂含量整体柱基质背压2.致孔剂含量对整体柱背压的影响随着致孔剂（非良性溶剂）用量17孔结构——SEM图3K1#（50%致孔剂）SEM图图4K5#（10%致孔剂）SEM图样品号单体％交联剂％溶剂％致孔剂％

K1＃

24161050K5＃

24165010表4整体柱基质组成

孔结构——SEM图3K1#（50%致孔剂）SEM图图18孔结构——氮吸附法

该整体柱基质的孔都是中孔和大孔，孔径分布在50nm-90nm范围内最多。图5K1#（50％致孔剂）孔径分布图返回孔结构——氮吸附法该整体柱基质的孔都是中孔和大孔，孔19单体: 24%交联剂: 16%致孔剂: 50%溶剂: 10%整体柱基质聚合条件返回单体: 24%整体柱基质聚合条件返回20CEC分离组氨酸对映体结果

在＋6.0kV的分离电压下，以2mmol·L－1，

pH＝5.5磷酸盐缓冲溶液作运行液，分离D,L-组氨酸，所得CEC图。图6D,L-组氨酸CEC图

CEC分离组氨酸对映体结果在＋6.0kV的分离21表5缓冲液的pH值对分离效果的影响结论

缓冲液作运行液的pH值越高，BSA（pI=4.7）离解的负电荷越多，使正的电渗流越强，使保留时间越早。较高pH值的缓冲液作运行液时分离度下降是由于，正的电渗流较强，待分离对映体与手性选择剂的作用来不及很好地进行，就被带出毛细管。返回缓冲液pH

L-组氨酸tR（min）

D-组氨酸tR（min）分离度R5.0／／／5.56.236.681.06.05.025.560.4表5缓冲液的pH值对分离效果的影响结论返回缓冲液pH22Ⅳ实验创新点通过条件实验，用IR、测定背压、SEM和氮吸附法等方法，确定出最佳聚合条件，成功制备出毛细管电色谱柱。用手性毛细管电色谱柱分离组氨酸对映体，并考察了运行缓冲液pH值对柱效及分离度的影响,并从原理上作出解释。最简便的方法（环氧基法），用BSA蛋白对毛细管整体柱进行修饰，制成手性毛细管电色谱柱。

首次建立了采用IR法定性和定量分析整体柱基质表面的活性基团。Ⅳ实验创新点通过条件实验，用IR、测定背压、SEM和氮吸23前景展望

目前，CEC在药物分析方面已有广泛的研究，集中在与药物相关的杂质分离和手性药物的分离等。随着毛细管电色谱技术的不断完善和提高，将在生物技术、环境保护、农业化学、精细化工产品、