细胞培养方法

细胞株(系)细胞复苏戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。迅速放入38°C水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。在1000r/min速度下离心5〜10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1X109/L，置37C温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12〜24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106,则稀释10倍使细胞达到105即可。注意事项在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安甑或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5〜0C)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。细胞换液贴壁细胞(包括半贴壁细胞的换液)紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。将培养瓶放于37°C,5%CO2的培养箱内培养细胞的传代培养紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯.弃旧培养液，吸除或倒掉原瓶中的旧培养基(以25mL培养瓶为例)。漂洗：每瓶加入2mL，无钙、镁PBS液，漂洗贴壁细胞三次后倒掉。消化：每瓶加入1mL消化液(0.25%胰蛋白酶)，轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下待1/2细胞变园后加适量完全培养液终止。或细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2〜3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化)。在37°或25°以上环境进行消化。(放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。)终止：加入完全培养基适量(通常10-20%胎牛血清培养基)5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。离心：离心(1100rpm)沉淀细胞(5-10分钟)，去除培养基(含胰酶及EDTA)。计数：离心前先滴好计数板待计数，计算细胞的浓度。传代：离心后用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养(可1:3至1:5传代，在25cm2的培养瓶中长满细胞可达5*106/ml，经10倍稀释每瓶达105/ml即可，25cm2的培养瓶每瓶5ml培养液)。细胞冻存细胞冻存液：20%小牛血清10%二甲基亚砜DMSO70%1640培养液操作步骤：选对数增生期细胞，在冻存前一天换液。按常规方法把培养细胞制成悬液，计数，使细胞密度达5*107/ml左右，离心，去上清液。（冻存细胞数量要充分，密度达5*107/ml，在溶后稀释20倍时，仍能保持5*105ml数量）。一般25cm2的培养瓶满瓶才达到105.加入配置好的冻存液，与去上清液相同的量一滴一滴的加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞室培养液中加入保护剂10%二甲亚砜（DMSO）或甘油，可使冰点降低，使细胞内水份在冻结前透出细胞外。（细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSP和90-95%原来的细胞生长用之新鲜培养基均匀混合。注意由于DMSO稀释时会释放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。）分装于无菌冻存管中，每管1.5ml悬液。旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标志。冻存：冰箱4°C放2小时，-75°C过夜，转液氮保存，或4°，0°，-20°各30分钟，最后直接放入液氮中保存或-80°冰箱保存。细胞培养中各种污染的特点细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。黑胶虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题非同种细胞污染：即是细胞交叉污染，由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。细胞培养中生长良好细胞状态：体外贴壁生长的细胞可以通过观察细胞的折光率，状态好的细胞透光性好，就是看起来细胞发亮，另外就是细胞胞浆内颗粒状物质较少，细胞胞浆体积较小，整个细胞的外形比较紧凑，没有肥大.还有就是细胞生长均匀,如果某一小片细胞过多或者过少，细胞状态必然不好。经传代或换液后生长状况良好的细胞在显微镜下观察时透明度大、折光性强、轮廓不清，用相差显微镜观察能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。细胞生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞之间空隙加大，细胞变得不规则，失去原有特点，上皮样细胞可能变成纤维样细胞的形状，有时细胞表面和周围出现丝絮状物质，如果情况进一步严重，可以出现部分细胞死亡、崩解、漂浮。可传代的细胞状态健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。细胞没生长到足以覆盖的瓶底壁的大部分表面前，不要急于传代。尽量少传代，避免转化。需要换液的细胞状态细胞换液是根据细胞的生长来决定的，当细胞生长旺盛的时候,培养液会很快变黄，那换液就要勤一些，如果生长的慢,换液时间就要延长.通常细胞培养液中会