桂东南地区芋疫菌株的分离鉴定及is序列分析

桂东南地区芋疫菌株的分离鉴定及is序列分析

芋头是天南星科的一种类似植物，属于多年生单胞菌。在中国，芋头通常被用作一级蔬菜。主要品种有香芋头和槟榔芋头，它们被地下茎食用。其球茎富含淀粉、蛋白质、多聚糖及多种人体必需的维生素和矿物质,是江南地区重要的粮、菜兼用作物之一。广西素有种植芋头的传统,近年来,随着农业产业化的调整,芋的种植面积不断扩大,广西荔浦芋(槟榔芋)是广西著名的名特优农产品,种植历史悠久,是荔浦县主导产业之一,2011年种植面积达3667hm2,芋头产品远销广东、香港、澳门及东南亚等地区,桂东南地区不同县份均有芋头的分布。芋疫病是芋头最常见、最主要、造成损失最严重的病害之一(LinandKo,2008),在广西各芋头产区发生严重。据报道,芋疫病在广西贺州市常年发生面积900~1200hm2,产量损失约20%,2002年芋疫病大发生,损失产量40%以上(谭光新,2003,广西植保,16(3)14-36)。芋疫病由芋疫霉(PhytophthoracolocasiaeRaciborski)引起,芋疫霉隶属卵菌门(Oomycota)、霜霉目(Peronosporales)、疫霉属(Phytophthora),其营养生长阶段为二倍体,有性生殖营卵配生殖,通过藏卵器和雄器的接触交配产生卵孢子(有性孢子),卵孢子是疫霉菌度过不良环境及越冬的主要菌态(陆家云,2001)。疫霉菌的有性生殖存在同宗配合和异宗配合两种类型,其中异宗配合又包括种内和种间的配合。和大多数疫霉属卵菌一样,通常认为芋疫霉为异宗配合菌物,一般需要两种交配型的菌株相互诱导才能进行有性生殖产生卵孢子。虽然Lin和Ko(2008)在台湾发现了芋疫霉的个别同宗配合种,但异宗配合类型仍然是各个地区芋疫霉最主要的有性生殖行为,同宗配合菌株见诸报导的不多。本项研究主要以桂东南地区芋疫霉的不同菌株为研究对象,测定不同菌株的交配型,明确桂东南地区芋疫霉交配型类型,为更好地指导病害的综合防治提供依据。1结果与分析1.1成长病斑,病斑中心芋疫病主害叶片,也侵染叶柄和球茎。叶上初生黄褐色圆形斑点,成长病斑近圆形有轮纹,晕圈水渍状暗绿色或黄色。病斑中央多腐败穿孔,严重时仅残留叶脉呈破伞状。潮湿时斑面生白色粉状霉,并有黄至淡褐色胶质分泌物(图1)。1.2甘薯的形态特征1.2.1生长生长情况芋疫霉在10%V8培养基上室温(25~29℃)下生长较快,但不同菌株生长速度存在较大差异。在所分离获得的12个菌株中,G-1、G-5、G-9、G-12、G-26号菌株生长速度较快,G-14、G-15、G-29生长稍慢,G-22号菌株生长速度较慢,G-7、G-10及G-18号生长最慢,培养后前3d几乎完全不长,到第5天菌落直径约4cm。菌落圆形,边缘整齐,整体呈浅黄至黄白色,但依据不同菌株及培养条件略有差异。其中G-1、G-5、G-9、G-10、G-12、G-22菌株的菌落色淡,黄白色,质地均匀致密,表面较光滑,轮纹明显或不明显,菌丝分布均匀,罕有气生菌丝。G-7、G-18、G-26、G-29菌株的菌落黄白色,轮纹明显,质地均匀但较粗糙,表面有少许白色絮状气生菌丝,白色霜粉状孢子囊丰富。G-14、G-15菌株菌落放射状圆形,浅黄色,质地致密但不均匀,放射处较厚,表面有少许白色絮状气生菌丝或白色霜粉状孢子囊丰富。但各类型菌株间菌落又不完全相同,相互之间各自存在一些交叉差异。比较培养发现,辣椒疫霉(HD-3和S-5菌株)在25℃自然光照下,10%V8培养基上生长速度明显比芋疫霉快,气生菌丝旺盛。而芋疫霉生长较慢,各菌株生长速度不一致,气生菌丝少至中等(图2)。1.2.2水曲奇类型,大小为半干形法生长,有以下几种显微镜下观察,各菌株孢子囊、孢囊梗、菌丝、乳突等微观形态均表现一样,与陆家云、郑小波等的描写基本一致(郑小波,1997;陆家云,2001)。菌丝无隔,多核,无色透明,单轴直角状分枝或不分枝,气生菌丝不分枝,宽约3.2μm。孢囊梗与菌丝相似,较菌丝细,一般2~4μm,有分隔,简单合轴分枝或不规则分枝,分枝处偶有膨大或缢缩。孢子囊卵形、椭圆形或洋梨形,孢子囊具半乳突,厚1.6~3.5μm左右,平均约2μm。孢子囊易脱落,孢囊柄中等长度,一般较孢囊梗细,透明,长度约在3.1~18.4μm之间,平均长度为9.6μm左右。游动孢子在孢子囊内产生,有些菌株清晰可见,圆球形,直径约4μm。孢子囊释放游动孢子时,乳突破裂,排孢孔宽约4.7μm,游动孢子通过排孢孔很快挤出,并迅速游开,通常每个孢子囊可以产生数个游动孢子。未见厚垣孢子产生。芋疫霉与辣椒疫霉异宗配合在两菌交接处可产生卵孢子。25℃黑暗条件下培养10d后,显微镜下可观测到卵孢子产生。卵孢子圆球形,壁黄褐色,内有浅色液泡或脂肪体;藏卵器球形,壁光滑,无色至浅黄色,穿雄而生,柄棍棒形;雄器扁圆形,围生于藏卵器柄,无色透明。卵孢子常不满器。成熟的卵孢子橘黄色至黄褐色,藏卵器黄褐至深褐色(图3)。1.3菌株获得大小及结果以待测的芋疫霉12个菌株的总DNA为模板,ITS1和ITS4为引物进行PCR,结果发现所有菌株均可获得大小为800bp左右的产物。测序结果表明,所有序列与GenBank发表的P.colocasiae不同分离物序列同源性达97%~100%,进一步确定待测的12个菌株均为芋疫霉(P.colocasiae)。1.4b特点生长、诱导诱导,未形成卵孢子待测菌株与辣椒疫霉A1、A2交配型菌株的不同组合对峙培养10d后显微镜下观察俩菌交界处的卵孢子。结果发现,所有待测的12个芋疫霉菌株和辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株的对峙培养交界处均可观察到卵孢子,说明待测的12个菌株均属于A2交配型,A1交配型HD-3菌株和A2交配型S-5菌株对峙培养可产生卵孢子,而待测菌株与A2交配型S-5菌株对峙培养,待测菌株、A1交配型HD-3菌株及A2交配型S-5菌株单独培养均未见卵孢子产生,说明待测菌株无A1交配型及其它交配型(表1)。在培养基平板上,具有亲和性并能产生卵孢子的两个菌株长到一定程度时会交接在一起,在交界处形成一条清晰可见、颜色偏白的卵孢子弧带;不可亲和性菌株通常生长到一定程度,在俩菌落快要交接时即停止生长或生长速度下降,在俩菌株之间形成一条弧形的沟界,沟界上菌丝稀少,与培养基同色,不交配形成卵孢子。辣椒疫霉A1、A2交配型菌株通常生长速度较快,气生菌丝旺盛,故在配对菌落上会呈现交配型菌株半包围待测菌株的态势,容易辨认(图4;图5)。2生产习惯型,芋疫霉主要以卵孢子随病残体在土壤中越冬,卵孢子壁厚,抗逆能力强,存活时间久,据报道,可达5年以上(赖传雅和袁高庆,2008),是芋疫病的重要初侵染源。因此,自然条件下,病菌有性生殖能否发生就成了该病害第二年发生严重程度的关键。2.1a型区a型研究结果表明,桂东南地区7县市采集到的芋疫霉12个菌株中,所有菌株均属于A2交配型,未见A1交配型,因此可推断,该地区芋头产区田间种内几乎不存在发生有性生殖的可能。芋疫病初侵染应该主要是带菌球茎,发病植株产生的无性孢子(孢子囊和游动孢子),通过风雨等途径传播,是当季病害发生与流行的主要因素。2.2植物对模拟人民设计植物的致病性情况研究研究发现,芋疫霉A2交配型能与辣椒疫霉A1交配型相互诱导发生有性生殖,交配产生卵孢子。辣椒疫霉是一种比芋疫霉更常见的疫霉菌,寄主范围十分广泛,据统计,能为害茄科(Solanaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、豆科(Leguminosae)等9科21种栽培植物和杂草(周启明等,1984,中国蔬菜,(1):40-43)。自然条件下,辣椒疫霉能否侵染芋头的研究尚未见报道。同时,桂东南地区辣椒疫霉的交配型目前尚不明确。芋疫霉与辣椒疫霉交配产生的后代能否稳定遗传,其对芋头的致病力情况如何也有待进一步研究。芋头是无性繁殖的作物,综上所述,对于桂东南地区芋头疫病的防治,应把重点放在块茎消毒及无病留种上,辅以土杂肥处理,同时应特别注意不与茄科、葫芦科、豆科等辣椒疫霉的寄主轮作、间种,及时清除田间杂草,减少病害的初侵染来源。3材料和方法3.1芋疫霉菌分离和培养从桂东南地区的罗城、北流、容县、浦北、合浦、东兴及南宁等7个县市的9个乡镇各芋头产区采集具有典型芋疫病症状的叶片,用组织分离法于芋疫霉选择性培养基上分离获得12个芋疫霉菌株。不同菌株的采集地点及编号见表2。部分菌株由中国农业大学植物病理学系刘西莉教授课题组分离获得,用10%V8培养基于4℃下保存各菌株待用。3.2s-5菌株惠4辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株、A2交配型S-5菌株由中国农业大学植物病理学系刘西莉教授课题组惠赠。其中,A1交配型HD-3菌株采自河北,A2交配型S-5菌株采自陕西。3.3加双蒸水加琼脂质盐soupcarany参考Tyson和Fullerton(2007)的配方配成10%V8培养基,即每100mLV8蔬菜汁(美国CampbellSoupCampany)加双蒸水(doubledistilledwater,ddH2O)900mL,CaCO32g,琼脂粉15g,混匀后在微波炉内加热熔化,分装,121℃高压蒸汽灭菌40min。使用前在每200mL10%V8培养基中加入1mL混合药液(每10mL混合药液中含氨苄青霉素,利福平,多菌灵·五氯硝基苯各0.1g)制成芋疫霉选择性培养基。3.4通过分析甘薯霉菌的形态用光学显微镜(OlympusBX51TRF)观察各菌株菌丝、孢囊梗、孢子囊、游动孢子及卵孢子的形态特征,并拍照记录。3.5通过测定甘薯、霉菌的混合类型3.5.1筛选配型菌株将分离并保存的所有待测芋疫霉菌株及辣椒疫霉A1、A2交配型菌株移植到芋疫霉选择性培养基上,置于室温(22~25℃)自然光照条件下倒置培养一周。3.5.2疫霉交配型的确定采用直接配对法(郑小波,1997;范学臻,2008)进行对峙培养。用消毒牙签挑取活化培养一周的各待测单菌株及A1、A2交配型菌株菌块,大小约4mm×4mm,分别接种到90mm培养皿中的芋疫霉选择性培养基平板上,待测菌株分别与辣椒疫霉A1或A2交配型菌株进行对峙培养,两菌丝块间相距40~50mm左右。每处理设