第二章组培基本条件

第二章组培基本条件第1页，课件共152页，创作于2023年2月

第一节培养基及其配制一、培养基的成分无机盐（大量元素、微量元素）有机营养成分（糖、维生素、氨基酸）植物生长调节剂天然有机添加物质琼脂活性炭第2页，课件共152页，创作于2023年2月根据植物对元素的吸收量，分为：1、大量元素（大于0.5mmol/L）：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S；其中C、H、O为气体元素，其余6种为矿质元素。2、微量元素（小于0.5mmol/L）：Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl（一）、无机盐第3页，课件共152页，创作于2023年2月（一）无机盐

1.大量元素（MS培养基为例）序号化学式用量（mg/L）1KNO319002NH4NO316503KH2PO41704MgSO4.7H2O3705CaCL2.4H2O440第4页，课件共152页，创作于2023年2月（一）无机盐

2.微量元素（MS培养基）序号化学式用量（mg/L)1KI0.832H3BO36.23MnSO4.4H2O22.34ZnSO4.7H2O8.65Na2MoO4.2H2O0.256CuSO4.5H2O0.0257CoCl2.6H2O0.025第5页，课件共152页，创作于2023年2月（二）有机营养成分1、糖类种类：蔗糖、葡萄糖、果糖。其中以蔗糖最常用。作用：提供碳源、能量、保持培养基的渗透压。用量：1%～5%。第6页，课件共152页，创作于2023年2月

（二）有机营养成分2、维生素类

常用的有Vc、B1、B6、B12、烟酸、生物素等。第7页，课件共152页，创作于2023年2月

（二）有机营养成分3、氨基酸常用的有：甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸等水解酪蛋白(CH)和水解乳蛋白（LH）是多种氨基酸的混合物，在培养基中也时常添加。第8页，课件共152页，创作于2023年2月（三）植物生长调节物质

用量很小，但对外植体的生长和分化起着决定作用。影响最显著的是生长素类和细胞分裂素类。

第9页，课件共152页，创作于2023年2月1．生长素类种类：2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸NAA：萘乙酸IAA：引哚乙酸IBA：引哚丁酸作用：诱导愈伤组织、胚状体的产生，试管苗生根。第10页，课件共152页，创作于2023年2月2.细胞分裂素类种类

KT：激动素（6-糠基氨基嘌呤）

6-BA：6-苄基氨基嘌呤ZT：玉米素2-iP：2-异戊烯腺嘌呤。第11页，课件共152页，创作于2023年2月2.细胞分裂素类作用

促进细胞分裂，由愈伤组织或器官上分化出不定芽，促进芽的增殖。第12页，课件共152页，创作于2023年2月3、根和芽形成的激素控制特点

生长素与细胞分裂素的比值和绝对含量，控制着植物组织的形态发生。

生长素/细胞分裂素比值高：有利于根的形成低：有利于芽的形成适中：维持原组织生长而不分化第13页，课件共152页，创作于2023年2月第14页，课件共152页，创作于2023年2月（四）天然有机添加物常用种类和浓度为：椰子乳10%酵母提取物0.5%番茄汁5%～10%香蕉泥100～200mg/L作用是提供微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。

第15页，课件共152页，创作于2023年2月

（五）琼脂

从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，作为凝固剂，不参与代谢。用量：0.6%～1.0%。

第16页，课件共152页，创作于2023年2月

（六）活性炭来源：用木炭粉碎加工形成。作用：吸附作用，减轻有害物质对培养物的毒害。吸附没有选择性，在吸附有害物质的同时，也吸附有用物质。使培养基变黑，有利于生根。用量：0.1％－0.5%。第17页，课件共152页，创作于2023年2月二、培养基的种类和选择1、基本培养基和完全培养基基本培养基：包括无机盐、维生素、氨基酸、糖和水等。完全培养基：在基本培养基的基础上，根据培养目的，添加其它一些物质。如：植物生长调节物质，天然有机物（椰乳、香蕉泥等）。

第18页，课件共152页，创作于2023年2月MS培养基配方硝酸铵1650硫酸锌8.6硝酸钾1900氯化钴0.025氯化钙440硫酸铜0.025硫酸镁

370钼酸钠0.25磷酸二氢钾170碘化钾0.83硫酸亚铁27.8

肌醇

100

EDTA-Na237.3烟酸0.5硼酸6.2盐酸吡哆素0.5硫酸锰22.3盐酸硫胺素0.1甘氨酸2mg/L第19页，课件共152页，创作于2023年2月2、基本培养基的种类种类：众多，有几百种，但较常用的仅一二十种。名称：多数以发明人的姓名来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)第20页，课件共152页，创作于2023年2月3、培养基的类型3.1高盐浓度培养基：MS、B5等。适用于多数营养需求量较大的植物。3.2中等盐浓度培养基：Nitsh、Miller等大量元素浓度约为MS的1/2。3.3低盐培养基：WPM、White等。大量元素浓度约为MS的1/4。适用于木本植物的培养。第21页，课件共152页，创作于2023年2月4、培养基的选择不同植物、培养部位和培养目的应选择不同的培养基。在建立一个新的实验体系时，一般先由一种已被广泛采用的培养基开始（如MS、N6、B5等）。第22页，课件共152页，创作于2023年2月三、培养基的配制方法

（一）、流程图

第23页，课件共152页，创作于2023年2月（二）母液配制（以MS培养基为例）氯化钙铁盐大量元素微量元素有机物质第24页，课件共152页，创作于2023年2月配制MS培养基时母液的计算第25页，课件共152页，创作于2023年2月（二）、母液的配制扩大倍数：10～100倍。意义：提高工作效率，减小称量误差。药品称量一次，就可以使用多次。第26页，课件共152页，创作于2023年2月1、母液配制原则

相同类型的试剂混合；易沉淀的药品分开；母液浓度要适宜；用量要认真计算和核对；药品要准确称量。

第27页，课件共152页，创作于2023年2月2、大量元素母液（扩大10倍）成分规定量(mg/L)称取量(mg)母液体积（ml)配1升培养基用量（ml)KNO3NH4NO3

MgSO4.7H2OKH2PO4190016503701701900016500370017001000100CaCl2.2H2O44044001000100第28页，课件共152页，创作于2023年2月

母液体积配1升培养基用量＝

扩大倍数第29页，课件共152页，创作于2023年2月3．微量元素母液铁盐容易形成Fe(OH)3沉淀硫酸亚铁与Na2-EDTA混合，形成络合物。其它微量元素分别充分溶解后混合定容为一瓶，扩大倍数为100倍。

第30页，课件共152页，创作于2023年2月3、微量元素母液（扩大100倍）成分规定量(mg/L)称取量(mg)母液体积（ml)配1升培养基用量（ml)MnSO4.4H20ZnSO4.7H2OH3BO3KINa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O22.308.606.200.830.250.0250.025223086062083252.52.5100010第31页，课件共152页，创作于2023年2月4、铁盐母液（扩大100倍）成分规定量(mg/L)称取量(mg)母液体积（ml)配1升培养基用量（ml)Na2-EDTAFeSO4.4H2O37.3027.8037302780100010第32页，课件共152页，创作于2023年2月5、有机物母液（扩大50倍）成分规定量(mg/L)称取量(mg)母液体积（ml)配1升培养基用量（ml)甘氨酸维生素b1维生素b6烟酸肌醇2.000.100.500.5010010052525500050010第33页，课件共152页，创作于2023年2月6．生长调节物质母液不溶于水，先溶于助溶剂。NAA、IAA、IBA、2,4-D及赤霉素、玉米素等，先溶于少量95%酒精，再加水定容；KT和BA等，先溶于少量的1mol/L盐酸中，再加水定容。第34页，课件共152页，创作于2023年2月6．生长调节物质母液

母液浓度：用量小，使用的浓度单位是mg/L，因此母液一般配制成0.1mg/ml，或1mg/ml；第35页，课件共152页，创作于2023年2月7．琼脂、蔗糖

用量大，不需要配制母液，随称随用。第36页，课件共152页，创作于2023年2月8、母液标签注明母液名称、配制1升培养基时应取的数量。大量元素100ml/L第37页，课件共152页，创作于2023年2月9、母液保存一般在2～4℃的冰箱中保存。生霉或沉淀，就不能再使用。第38页，课件共152页，创作于2023年2月(三)培养基的配制（按1L计）

1、确定配方MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂2、配方用量计算大量元素（扩大10倍配1L）微量元素（扩大100倍配1L）有机物（扩大50倍配500ml）铁盐（扩大100倍配1L）6-BA(1mg/ml)NAA(0.1mg/ml)蔗糖琼脂100ml10ml10ml10ml1.5ml2ml30g8g第39页，课件共152页，创作于2023年2月

称8g琼脂、30g蔗糖放在搪瓷杯里，加入约700ml蒸馏水，电炉上加热溶化。3、琼脂和蔗糖的溶化第40页，课件共152页，创作于2023年2月4．母液的量取和定容用移液管（不能混用）或量筒将母液依次加入烧杯中。再与已溶化的琼脂、蔗糖混合、定容。第41页，课件共152页，创作于2023年2月5．pH值的调整A、不同植物对酸碱度的要求不同，多数培养基的pH值为5.6～6.0。B、常用1mol/L的NaOH和HCl调整pH值。C、pH影响培养基的硬度。pH＜5.0培养基不易凝固。D、灭菌后，培养基的pH会降低0.2－0.3。第42页，课件共152页，创作于2023年2月种类pH值杜鹃4.0月季5.8桃7.0不同植物的最适pH值

第43页，课件共152页，创作于2023年2月酸和碱的配制1mol/LNaOH：称取4g的NaOH，溶解后定容至100ml。1mol/LHCl：量取8.4ml的浓HCl（12mol/L），定容至100ml。第44页，课件共152页，创作于2023年2月6．培养基的分装分装量：随培养容器大小而异，约一指厚即可。注意：不要把培养基粘到瓶口上，以免染菌。封口：封好瓶口，准备灭菌。第45页，课件共152页，创作于2023年2月（四）培养基的灭菌和保存1．消毒和灭菌的概念1.1消毒：指采用物理或化学方法杀死物体表面的微生物（不包括细菌的芽孢和真菌的孢子）。第46页，课件共152页，创作于2023年2月1.2灭菌：指采用物理或化学方法杀死物体表面及其内部的一切微生物（包括细菌的芽孢和真菌的孢子）。第47页，课件共152页，创作于2023年2月2．高温高压湿热灭菌

2.1灭菌条件

压力0.105MPa，温度121℃。2.2灭菌时间取决于待消毒液体容积的大小，15-30min.第48页，课件共152页，创作于2023年2月培养基灭菌最少时间

液体容积（ml）121℃下，时间（min）

20～501575～15020250～50025100030第49页，课件共152页，创作于2023年2月手提式高压锅灭菌步骤装锅加水盖锅盖通电加热排冷空气升温保压断电降压出锅冷却第50页，课件共152页，创作于2023年2月2.3灭菌操作

将培养瓶放入灭菌锅，盖好锅盖。压力上升到0.05MPa时（111℃），打开“放气阀”将冷空气排尽，关闭“放气阀”。压力达到0.105MPa时（121℃），维持足够时间，关闭电源。待压力回复到“0”时才可以开启灭菌锅。第51页，课件共152页，创作于2023年2月2.4排除冷空气的重要性

冷空气使锅内温度不一致，底层的温度达不到121℃，导致培养基不能充分灭菌。第52页，课件共152页，创作于2023年2月温度与排气的关系（0.105Mpa）

排气量完全排除2/31/21/3未排除温度/℃121115112109100第53页，课件共152页，创作于2023年2月3．过滤除菌在高温下易分解的试剂，如GA3、IAA、椰子汁等，用过滤除菌。滤膜孔径为0.45μm。

第54页，课件共152页，创作于2023年2月3．过滤除菌过滤器漏斗型：大量液体过滤注射器型：小量液体过滤为加速过滤，可在漏斗下安真空泵抽气。需在超净工作台上进行，所有器皿事先需要灭菌。第55页，课件共152页，创作于2023年2月A、漏斗型过滤除菌装置B、注射器型过滤除菌装置第56页，课件共152页，创作于2023年2月

过滤灭菌

滤膜Ø0.45um以下1.过滤器先灭菌，灭菌温度不超过121℃。2.溶液先进行初滤第57页，课件共152页，创作于2023年2月4．培养基的保存一般等培养基冷却后即可使用。为保险起见，也有在培养室中预培养2～3d，如果没有出现杂菌污染才使用的。第58页，课件共152页，创作于2023年2月第二节

实验室的设置选址：选择采光良好、通风、清洁的地方作实验室。规模：根据需要与可能性来安排，不可一概而论。可新建或旧房改造。第59页，课件共152页，创作于2023年2月一、实验室设计原则1、方便

规模化生产的组培实验室，尽量将主要功能房间集中在同一层楼，方便操作。

第60页，课件共152页，创作于2023年2月2、

无菌设一走道，先经过走道再进入实验室，保持清洁，减少污染。接种室外设一缓冲间，以便更换衣帽等。缓冲间及接种室内均需安装紫外灯，可随时消毒。第61页，课件共152页，创作于2023年2月3、节能培养室应设在房屋的南面，设大窗户，尽量利用自然光照，减少照明费用，降低成本。培养室房间不宜太大，门装成滑门，便于保温，节省能源。第62页，课件共152页，创作于2023年2月培养室的大窗子第63页，课件共152页，创作于2023年2月4、安全

接种室处于密闭状态，容易造成室内空气污浊，影响身体健康。安装空气循环过滤装置，保持室内空气新鲜。第64页，课件共152页，创作于2023年2月洗涤室配制室灭菌室接种室培养室组培实验室观察室二、实验室设置储存室第65页，课件共152页，创作于2023年2月实验室平面图一第66页，课件共152页，创作于2023年2月配制室灭菌室观察室贮藏室走廊

洗涤室培养室接种室培养室实验室平面图二第67页，课件共152页，创作于2023年2月三、实验室功能设置（一）贮藏室

贮存暂时不用的器皿、用具、药品等，也可用作种质保存。第68页，课件共152页，创作于2023年2月功能：玻璃器具的清洗、干燥和贮存。

配备：上下水、水槽（二）洗涤室蒸馏水器放在这间，利用冷却水洗涤，既暖和又提高了水的利用率。第69页，课件共152页，创作于2023年2月（三）配制室功能：培养基配制配备：药品柜、天平、工作台、冰箱等第70页，课件共152页，创作于2023年2月配制室的设置及配备第71页，课件共152页，创作于2023年2月药品柜冰箱天平第72页，课件共152页，创作于2023年2月配制室的设置及配备第73页，课件共152页，创作于2023年2月功能：培养基灭菌

配备：高压灭菌锅（四）灭菌室第74页，课件共152页，创作于2023年2月灭菌室的设置及配备第75页，课件共152页，创作于2023年2月（五）接种室功能：材料消毒、接种、转移培养物。结构：接种室+缓冲间(2m2)配备：超净工作台

面积：10－20m2

要求:墙壁光滑、配置梭门，门窗严密。第76页，课件共152页，创作于2023年2月超净工作台电子灭菌器臭氧灭菌机第77页，课件共152页，创作于2023年2月缓冲间第78页，课件共152页，创作于2023年2月接种室第79页，课件共152页，创作于2023年2月接种操作第80页，课件共152页，创作于2023年2月（六）培养室配备：培养架、照明、控温设备面积：根据规模定

功能：材料培养

第81页，课件共152页，创作于2023年2月培养室第82页，课件共152页，创作于2023年2月1、温度控制培养温度：一般25±2℃。安装空调；在不需要降温的地区，可用“电炉+温度指示控制仪”，实现自动控温。

第83页，课件共152页，创作于2023年2月温度指示控制仪＋电炉第84页，课件共152页，创作于2023年2月2、辅助光照光照强度：1000－6000Lux，除了开设大窗户，充分利用自然光外，还需安装辅助光源。日光灯安装在培养架上。第85页，课件共152页，创作于2023年2月第86页，课件共152页，创作于2023年2月2、辅助光照每层培养架安装2支日光灯，光强2000～3000Lux。安装自动计时器（微电脑时控开关）控制光照时间，可实现自动控制。第87页，课件共152页，创作于2023年2月微电脑时控仪第88页，课件共152页，创作于2023年2月（六）观察室功能：观察培养材料的生长分化情况。

配备：显微镜，切片机等。第89页，课件共152页，创作于2023年2月第90页，课件共152页，创作于2023年2月第三节常用仪器和用具

（一）天平1．药物天平（粗天平）

称量精度为0.1g，称取蔗糖、琼脂以及用量较大药品。第91页，课件共152页，创作于2023年2月2．分析天平

精度为0.1mg，称取微量元素和植物激素等。放置天平的地方，要平稳、干燥，避免腐蚀性药品和水气。第92页，课件共152页，创作于2023年2月药物天平分析天平第93页，课件共152页，创作于2023年2月（二）高压蒸汽灭菌锅组培最基本的设备，用于培养基、器械等的灭菌。有大型卧式（200L）、中型立式（50L）、小型手提式（18L）等多种，可根据生产规模和财力加以选用。大型的效率高，小型方便灵活。

第94页，课件共152页，创作于2023年2月手提式灭菌锅

第95页，课件共152页，创作于2023年2月各种型号的高压灭菌锅第96页，课件共152页，创作于2023年2月大型卧式灭菌锅第97页，课件共152页，创作于2023年2月第98页，课件共152页，创作于2023年2月（三）烘箱玻璃器皿烘干：温度80-100℃。干热灭菌：温度150～160℃，持续1～3小时。第99页，课件共152页，创作于2023年2月（四）冰箱

用于试剂和母液的保存。家用冰箱即可，宜选用冷藏室较大的型号。第100页，课件共152页，创作于2023年2月冰箱第101页，课件共152页，创作于2023年2月（五）酸度计笔式酸度计较方便，在使用之前应先进行校正，使用之后将电极冲洗干净，并将电极浸泡在蒸馏水中。也可用精密pH试纸（pH值5.4～7）来代替。测定pH值时，应搅拌均匀后再测。第102页，课件共152页，创作于2023年2月（六）蒸馏水器

组培常用蒸馏水或无离子水，蒸馏水可用金属蒸馏水器大批制备。

第103页，课件共152页，创作于2023年2月蒸馏水器规格出水量（L/h）51020功率（千瓦）4.57.515第104页，课件共152页，创作于2023年2月（七）空调机

用于培养室恒温控制，根据培养室大小，选装不同功率的。第105页，课件共152页，创作于2023年2月（八）超净工作台用途：接种、转苗的无菌工作台面。型号：有单人、双人及三人式的，有开放和密封式的，有垂直送风和水平送风的类型。

第106页，课件共152页，创作于2023年2月超净工作台第107页，课件共152页，创作于2023年2月超净工作台第108页，课件共152页，创作于2023年2月（八）超净工作台原理:将空气过滤后流过工作台面。维护：放在空气干净，地面清洁的地方。使用过久，引起堵塞时，需要清洗和更换过滤网。第109页，课件共152页，创作于2023年2月（九）解剖镜用于培育脱毒苗时剥取茎尖，以及隔瓶观察培养物的生长情况。第110页，课件共152页，创作于2023年2月体视显微镜倒置显微镜第111页，课件共152页，创作于2023年2月显微镜倒置显微镜第112页，课件共152页，创作于2023年2月（十）培养架架子用金属、木材制作，隔板用玻璃、金属筛网。一般设5层，最低一层离地10cm，其他层高30cm，培养架高1.7m左右，宽60cm。每层台板上方安装日光灯作辅助光源。第113页，课件共152页，创作于2023年2月培养架第114页，课件共152页，创作于2023年2月培养架第115页，课件共152页，创作于2023年2月培养箱第116页，课件共152页，创作于2023年2月光照培养箱第117页，课件共152页，创作于2023年2月（十一）驯化设备温室大棚第118页，课件共152页，创作于2023年2月二、必要的用具（一）玻璃器皿

1．计量器皿

①量筒②容量瓶

③吸管

2．烧杯3．试剂瓶

第119页，课件共152页，创作于2023年2月计量器皿第120页，课件共152页，创作于2023年2月对玻璃器皿要求：

1.耐腐蚀；耐高温、高压；

2.透明度好；

3.便于接种。第121页，课件共152页，创作于2023年2月4．培养瓶早期用试管、三角瓶，不好操作。现在一般是用果酱瓶(250ml、350ml)，瓶口大，操作方便。也有用其它培养容器的。第122页，课件共152页，创作于2023年2月第123页，课件共152页，创作于2023年2月5．酒精灯用于金属器具的灭菌；及在火焰边无菌操作。第124页，课件共152页，创作于2023年2月（二）金属器械1．镊子

16－25cm长的枪状镊子，因其腰部弯曲，使用方便。

第125页，课件共152页，创作于2023年2月镊子第126页，课件共152页，创作于2023年2月灭菌器推车第127页，课件共152页，创作于2023年2月2．剪刀12～15cm长的弯头剪好用，特别适用于培养瓶内剪苗。

第128页，课件共152页，创作于2023年2月（三）封口材料小瓶口：常用棉塞，外面再包一层牛皮纸；也可用铝箔包住。大瓶口：常用塑料瓶盖、薄膜、双层硫酸纸。第129页，课件共152页，创作于2023年2月

第四节环境条件一、温度1、培养温度

多数为25±2℃，并保持恒温培养。

不同植物的温度不同，如：百合20℃、月季25-27℃、番茄28℃。第130页，课件共152页，创作于2023年2月培养温度

喜温植物培养温度较高，26-28℃。如茄科、葫芦科等。耐寒植物培养温度较低，18-22℃。如百合科、十字花科、菊科等。

第131页，课件共152页，创作于2023年2月2、低温预处理在花药培养中，通过低温预处理，可以促进细胞的脱分化和再分化。如：采用3℃预处理48小时，可使曼陀罗花粉的胚状体诱导率提高33.6%。第132页，课件共152页，创作于2023年2月二、光照1、光周期1.1愈伤组织诱导：暗培养较好。1.2器官发生：需要周期性光照，光照时间12－16h。第133页，课件共152页，创作于2023年2月2、光照强度范围1000-6000lx,常用3000-4000lx。采光好的培养室，自然光就可满足；采光差的培养室，用日光灯为辅助光源。第134页，课件共152页，创作于2023年2月

三、通气状况固体培养时，培养物不能埋入培养基。液体培养时，则需进行振荡或浅层培养以保证氧气供应。第135页，课件共152页，创作于2023年2月第五节组培方案的筛选一、组培方案筛选步骤文献检索预备试验参观咨询最佳组培方案筛选正规试验第136页，课件共152页，创作于2023年2月二、文献检索

◆植物的学名、品种名、商品名◆此种植物组培的相关报道第137页，课件共152页，创作于2023年2月三、收集、分析的技术信息A、外植体类型与取材时间；B、诱导、继代、生根培养基配方；C、培养条件（温度、光照、pH值等）；D、移栽驯化条件及基质配比。第138页，课件共152页，创作于2023年2月四、预备试验

针对某些关键因素简单拟定试验方案，粗略判断其是否有影响及影响程度、剂量的大致范围。观察。。。第139页，课件共152页，创作于2023年2月1、单因子试验2、多因子试验五、最佳组培方案的筛选第140页，课件共152页，创作于2023年2月1、单因子试验

培养基的其它成分保持不变，只改变一种成分，从而筛选出最佳培养基