水稻原生质体分离及转化

水稻原生质体分离及转化作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验实验材料和试剂：生长8-10d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5mL移液枪、5mL枪头、12mLBD管、1.5mLEP管、100mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网(20mmx20mm)、离心机、摇床等。溶液的配制：母液的配制：1、 0.2MMES(pH5.7)2、 0.8MMannitol(甘露醇)3、 1MCaCl24、 2MKCl5、 2MMgCl26、 10%BSA[FlukaPEG400081240]以下如有上述母液，则都是使用的母液酶解液：20mL x2MES 0.5MannitolmL-35：『…，ddH2OmL55°C10min冷却至RT后加入200uLCaCl2加入200uL10%BSAMmg:20mLMESmLMannitolmLMgCl2mLddH2OmL7.515mL0.150.3g0.0750.15g1.83.6mLx20.20.4mL510mL0.0750.15mL4.7259.45mLPEG-CaCl2:PEG-CaCl2:20mLMannitolmLCaCl2mLPEG4000gddH2OmLx22.5mL12mL48g3TOC\o"1-5"\h\zmLW5:200mLMES 2mLNaCI 1.8gCaCl22H2O 3.67525gKCI 0.5mLddH2O 197.5mL具体实验步骤：1、 从培养基上切取培养8-10d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。3、将酶解液（约20mL）倒入100mL锥形瓶中，然后轻轻地将细碎的幼苗倒入锥形瓶中（注意不要撒到锥形瓶壁上），然后轻轻地摇晃，使其均匀分散。4、 黑暗条件下（用不透光的黑色塑料袋包裹即可，下同）置于摇床中（60rpm/min）摇晃5h，使细胞充分酶解。此时也可以将PEG-CaCl2溶液一同置于摇床上摇晃，使溶质充分溶解。5、 从摇床中取下已经酶解好原生质体的锥形瓶，用手轻轻摇匀后，再用移液枪吸取锥形瓶中已经酶解好的液体，让其经过过滤网（20mmx20mm）过滤后流入到BD管中。6、 接着用W5溶液来洗涤锥形瓶中剩余的残渣，然后同样用移液枪将其吸出，经过过滤网后流入到BD管中，此步骤按照需要重复2-3次（尽量收集到更多的原生质体），所需要收集原生质体的BD管数按照需要来决定。7、 收集完后，将含有原生质体的BD管置于离心机中，1200rpm离心3min。8、 去掉BD管中的上清后，用W5溶液（约6mL）洗涤沉淀，然后1200rpm离心3min。9、 重复步骤8一到两次。10、 去掉BD管中的上清，再在含有沉淀的BD管中加入mmg（加入的量根据液体的颜色来自行判断），然后将其混匀。11、 Mmg加入完毕并混匀后，可吸取其中少量液体到计数板上，然后置于显微镜下观察（主要是查看原生质体是否完整、浓度是否达到和是否还含有大量的杂质），有时候凭经验而可以省去这一步。12、 接着将BD管中的液体转移到事先已经装有质粒的另外的BD管中（加入的量根据每100uL原生质体中加入10-20ug质粒来确定，如果是双转，则每一种质粒都要加入这么多的样，即双倍的质粒），在这里可以转小量GFP对照来测定原生质体的转化效率。13、 再加入等体积（原生质体+质粒）的PEG-CaCl2溶液（溶液比较粘稠，注意慢慢吸取），轻轻混匀。14、 黑暗条件下静置15min（让质粒转入原生质体中）。15、 然后加入1-2倍体积的W5溶液（终止反应）。16、 混匀后，1200rpm离心3min，倒去上清。17、 在沉淀中加入少量W5（约1mL）混匀。18、 最后将其吸取倒入事先加有6mLW5的培养皿（事先经过胎牛血清润洗，以便原生质体均匀分散在培养皿中）中，并混匀。19、 黑暗条件下静置培养16h（让质粒在原生质体中表达出蛋白）。20、 从黑暗中取出培养的原生质体，待吸去培养皿中一部分清澈的液体后，再用枪头将培养皿中剩余的液体和原生质体打匀，然后用移液枪将其吸取至新的BD管中。21、 接着将BD管中的原生质体分装到1.5mL的EP管中（分装的管数按需求决定）。22、 此时可在EP管中加入不溶的PGN和Chitin进行处理，处理浓度为200ug/mL,处理时间为10min，处理时可上下颠倒摇晃EP管，这能让PGN和Chitin充分处理到原生质体。23、 然后将EP管置于离心机中，12000rpm，离心1min。24、 吸去EP管中的上清液，然后迅速将其置于液氮中，最后置于-80°C中冻存，待需要使用时再取出。一、4注意：1、 配制溶液前需配制相关试剂母液，而且需要过滤除菌。2、 溶液配制好后也需要过滤除菌。3、 所用的器具最好是平时专门使用的，防止交叉污染。4、 由于原生质体容易破裂，所以摇晃、打匀和转移原生质体的时候动作必须要轻。实验一：GFP转原生质体转化效率观察黑暗条件下静置培养16h（让质粒在原生质体中表达出蛋白），取出已表达出GFP蛋白的原生质体，将原生质体打匀后再将其吸入2mLEP管，然后1200rpm离心3min，吸取大部分上清后再打匀原生质体，最后吸取少量原生质体置于载玻片上，接下来便可在荧光显微镜下观察GFP荧光了。实验二：用于BIFC实验实验三：用于Co-IP实验此方案来源于YangZhang,JianbinSuandHongbinWang*.Ahighlyefficientricegreentissueprotoplastsystemfortransie