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银杏叶总黄酮含量的季节性变化规律及乙醇提取工艺研究
银杏是银杏科的一种落叶树种。这是中生代遗迹的稀有树种,也是中国特有的植物。据不完全统计,我国目前银杏种植面积达13×105hm2,年产干青叶1.1~1.3×105t。银杏叶中含有多种生理活性成分,如黄酮类化合物、萜内酯等,具有改善心脑血管循环、抗过敏、抗病毒、抗癌、抗衰老及降低胆固醇等作用,而且银杏叶提取物毒副作用很小,食用安全,我国卫生部已批准将银杏叶提取物作为新的保健食品添加剂。本研究以银杏叶黄酮在食品中应用为目的,采用乙醇为溶剂提取银杏叶黄酮,为银杏叶食品的开发打好基础,从而加速银杏叶在食品中的应用。1材料和方法1.1试验材料银杏叶采集于西北农林科技大学西农校区内,芦丁为上海生化试剂厂提供,乙醇为95%食用酒精,符合GB10343-89标准。1.2测试方法1.2.1银杏叶黄酮含量的测定银杏叶采摘后洗净,于60℃烘干至恒重,粉碎、过筛,用索氏提取器加乙醇提取至无色,以络合——分光光度法测定提取液中总黄酮含量。1.2.2银杏叶总黄酮提取率计算方法银杏叶总黄酮提取率(%)=提取液中心黄酮的重/提取所用银杏叶中总黄酮含量×100%。1.2.3提取液的制备在1999年4月至12月,每月6号将从不同树上所采的银杏叶混匀,洗净,于60℃烘至恒重,粉碎后过筛,精确称取2.5g,用100mL乙醇进行索氏提取至提取液无色,测其总黄酮含量。1.2.4提取时间和浸提温度粒度(目):≥70、50~60、40~50、30~40、≤30;乙醇浓度(%):0、10、20、30、40、50、60、70、80、90;提取时间(h):1、2、3、4;浸提温度(℃):30、40、50、60、70、80;液固比(v/w):3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1;提取次数(次):1、2、3、4、5。1.2.5提取条件的确定根据1.2.4中影响银杏叶黄酮提取各因素的单因素试验结果,分别选取温度、乙醇浓度、液固比3因素进行正交试验,以确定银杏叶总黄酮的提取条件。2结果与分析2.1银杏在立地条件下至叶红酵母叶片生长的总黄酮含量的变化在1年生长季节内,银杏叶片中黄酮含量各月份的变化有其规律性(表1)。1年中,4月份叶片的黄酮含量最高,5月份叶片黄酮含量已大大下降,之后又逐月上升,8月份达到一个新的高峰,随后又逐渐回落,并持续至落叶。这一结果与A.Lobstein等人的结果相似。银杏在陕西关中地区于3月底萌动,4月上旬叶片逐渐展开。表1中4月份黄酮含量最高,这可能与上年树体贮存的营养物质有关。5月份是新梢和叶片速生期,消耗大量营养物质,导致总黄酮含量大幅度下降。之后随着气温的升高及光照的日益充足,黄酮在叶中积累不断增加,8月份达到一个顶点。从9月份开始,光照、气温逐渐减弱,叶片开始衰老,其中的黄酮含量也逐步下降。说明黄酮积累与光照有联系。虽然从测定结果看,干叶中黄酮含量在4月份最高,但由于4月份叶片幼嫩,水分含量高,干叶产量低,所以银杏叶采收的最佳时间应在8~9月。2.2提取处理对黄酮提取效率的影响2.2.1粒度对提取率的影响以70%的乙醇溶液提取,液固比为5∶1,于80℃条件下对不同破碎粒度的银杏叶提取2次,每次1h。结果(图1)表明,粒度不同,浸提效果也不同,粒度小,浸提效果好,但当粒度超过60目后,过滤困难,滤饼中残留的滤液较多,提取率反而下降。因此实际操作以粒度50~60目为宜。2.2.2次数和次数h选用粒度为50~60目的银杏叶,用不同浓度的乙醇溶液提取,液固比为5∶1,于80℃条件下分别提取2次,每次1h。由图2知,随乙醇浓度的增加,总黄酮提取率呈上升趋势。乙醇浓度在70%时提取效果最好,浓度进一步增加,提取率略有下降。乙醇浓度低于50%时,提取液中杂质含量较高,可能是蛋白质、糖类等水溶性物质大量溶出,提取液粘度较大,过滤、浓缩、分离均较困难,故选60%~70%乙醇作提取剂为宜。2.2.3不同温度对黄酮提取率的影响在不同温度下,分别以70%的乙醇溶液浸提50~60目粒度的银杏叶,液固比为5∶1,提取2次,每次1h,结果(图3)表明温度越高,总黄酮的提取率越高。这可能是由于黄酮在乙醇中的溶解度随着温度的升高而增大,同时由于温度升高,浸提液粘度减少,扩散系数增加,促使浸提速度加快。但温度过高时,热能消耗大,提取液中的活性成分也易被破坏,且杂质的溶出量增加,给后续操作带来不便,成本费用增大,综合各方面因素考虑,浸提温度以80℃左右为宜。2.2.4提取次数对银杏叶提取效果的影响在溶剂与银杏叶比例不同的条件下,用70%乙醇于80℃条件下对粒度为50~60目的银杏叶提取2次,每次1h,结果如图4。随着液固比的增大,提取率逐渐加大,当液固比达成到8∶1后,提取率增加不明显。而溶剂用量过大时,回收溶剂的成本增加。综合两方面因素考虑,生产中液固比以选择6∶1~8∶1较佳。2.2.5黄酮的提取时间在提取最初的2h内,银杏叶黄酮提取率随时间的延长呈直线上升,当达到2h后,提取率达70%。时间的延长对浸提效果影响不大,其原因可能是浸提液中黄酮浓度已基本与叶片中黄酮浓度达到平衡;在给定条件下,提取2次后,黄酮提取率已接近最大值。再增加提取次数,提取率增高很小,而且加大了溶剂用量,增加了成本。故提取次数以2次为宜。2.3黄酮提取条件的确定根据以上单因素试验结果,采用L9(34)正交试验表,分别以温度、乙醇浓度、液固比作为试验因素,各设置3水平试验,以确定银杏叶总黄酮的最佳提取条件。正交试验方案及结果如表2。从表2结果的方差分析得出,各因素对浸提效果影响的大小顺序是:浸提温度>乙醇浓度>液固比。其中,浸提温度对银杏叶总黄酮浸出率的影响达到极显著水平,温度越高,浸提效果越好。在选定的水平范围内,乙醇浓度提高则浸出率增大。在本试验的水平范围内,液固比各水平间的差异极小,对银杏叶总黄酮浸出率几乎没有影响。从分析结果看最佳的水平组合应为A3B3C2,即80℃、70%乙醇、液固比7∶1。但考虑到液固比大,则溶剂消耗多,在后续的溶剂回收、提取液浓缩等操作中能耗加大,生产成本较高。因此,确定生产中银杏叶黄酮的提取条件为:银杏叶洗净,60℃烘至恒重后,粉碎、过50~60目筛,用6倍(V/W)的70%乙醇于80℃条件下提取2次,每次1h。依照此法提取,银杏叶总黄酮提取率可达87.6%。3黄酮的水浸试验银杏叶破碎度对银杏叶总黄酮提取率的影响在于通过破碎可以增大扩散面积,同时减少扩散微粒的半径。在一定范围内,随着破碎度的增加,浸取率提高。另一方面,原料过于粉碎,过滤时滤饼中残留的滤液量增多,损失加大,以致提取率降低。所以,试验确定银杏叶总黄酮的提取中,粒度以50~60目为宜。随着提取时间的延长(在达渗透平衡之前),物质的浸出量应逐步提高,本试验中黄酮的浸出量遵循这一规律。在基本达到渗透平衡后,时间的延长对提取率影响不大。试验结果还显示,连续提取2h,银杏叶总黄酮提取率仅为70.2%,而每次提取1h,连续提取2次,提取率可达86.8%,这一结果同浓度差对扩散量的影响有关,连续提取2次,第二次提取时由于更换了新溶剂,浓度差大大提高,扩散率增大,同时由于是2次提取,溶剂量增加了1倍,渗透平衡时的浓度下降,浸出量提高,所以提取率加大。温度对浸提效果的影响,一方面浸提速度直接与浸提温度成正相关,另一方面温度升高,溶剂的粘度减少,也增大了浸提效率。试验结果显示,在选定的因素水平范围内,浸提温度对浸提效果的影响达到了极显著水平。但是,鉴于有效成分的热稳定性,以及温度升高时杂质溶出量也相
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