常见新生儿疾病动物模型的特点与比较

常见新生儿疾病动物模型的特点与比较荣箫周伟近年来，随着产科和新生儿重症监护治疗技术的发展，我国早产儿、低出生体重儿、多胎儿的出生率有明显增高趋势，新生儿疾病一直是儿科疾病中研究的热点。建立合适的动物模型是研究新生儿疾病的关键，可以避免在人身上进行实验所带来的风险，本文就目前常见新生儿疾病的各种动物模型的特点作一综合介绍和比较。一、实验动物的选择：迄今为止，用于建立新生儿疾病动物模型和进行各种相关研究的动物主要包括大鼠、小鼠、豚鼠、新西兰白兔、绵羊、狗、猪和灵长类动物。大鼠、小鼠、豚鼠、绵羊和新西兰白兔是常规的实验动物，其中啮齿类动物由于其遗传背景清晰，容易获得，操作简单，重复性好，价格经济，使用最为广泛，可用于发病机制、药理学及神经行为学等的研究。实验动物的选择通常以实验目的和动物各自的特点来决定。若实验中需要每天抽取子代血液作为标本，就应选择体形大一些的动物如绵羊，以使用留置导管，为实验提供方便；若进行以形态学和分子生物学检测技术为基础的实验，则适宜选择体形较小的动物；当需要设窝内对照时，新西兰白兔则是最佳的考虑对象，因为子兔在孕兔子宫内有着各自的羊膜腔；选用灵长类动物如恒河猴或猕猴作研究对象的价值在于：此类动物有与人类极其相似的生物学特性和解剖结构；猪的解剖和生理学与人类较为相似，也成为近年的研究热点。此外，为确保实验结果的准确性和可重复性，应尽量选用与研究内容相匹配的经遗传学、微生物学、环境及营养控制的标准化实验动物，才能排除微生物的干扰和潜在疾病对实验结构的影响，排除遗传污染造成的个体差异。二、常见的新生儿疾病动物模型(一)胎儿生长受限(fetalgrowthrestriction,FGR)模型1.子宫血管结扎法：早期的做法是于孕晚期完全结扎妊娠动物的双侧子宫动脉以减少胎儿营养素和氧的供给［1］，但这种做法在短时间内完全阻断了子宫动脉的血流，死胎率高，建模成功率相对较低。目前常用的做法是部分结扎子宫动脉［2］或部分结扎子宫动脉和子宫静脉［3］。部分阻断法建立的FGR动物模型具有与人类FGR更为类似的病理生理学特点，并且克服了上述死胎率高、发病率低等缺点。但其操作有一定难度，尤其是部分血管结扎，扎的过紧死胎率太高，扎的过松FGR发生率太低。另外，此法是在孕晚期施加干预,也就无法观察孕早、中期营养供应异常对子代生长发育的影响。2•营养干预法:低蛋白饮食和低能量饮食是建立FGR动物模型的常用方法，以采用低蛋白饮食法居多。低蛋白饮食组孕鼠孕期饲以含5%~8%蛋白的食物，对照组饲以含20%~25%蛋白的食物［4-6］。低能量饮食是指营养成分一致而实验组动物摄入食物总量低于对照组，中度者摄入对照组50%的量，而重度者摄入30%的量，一般以对照组前Id的食物消耗量为基础计算限制组当天的食物量。此法操作流程简单，实际应用亦很方便。但要造成胎儿发病、又不至于发生流产或死胎，其营养素的供应量难以摸索。另外，准确把握限制营养素的最佳时期也较为困难。被动吸烟法：被动吸烟法是每天多次将点燃的香烟放入笼中，使孕鼠被动吸烟。吸烟可产生多种毒性物质，它们均可降低胎盘灌流量及血液携带能力，并通过胎盘累及胎儿。被动吸烟法建立FGR动物模型的方法比较成熟，能很好的模拟临床实际情况，且建模成功率最高［7］，已经成为目前广泛使用的方法。但是香烟烟雾中所含成分多而复杂，要判断各成份的具体作用就比较困难。更生霉素法：腹腔注射更生霉素是建立FGR动物模型的另一种常用方法。更生霉素是一种周期性非特异性抗生素类抗肿瘤药物，其选择性地与DNA中的鸟嘌吟结合，抑制以DNA为模板的RNA多聚酶，从而抑制RNA的合成，使蛋白质合成受阻。此法操作简便，且FGR发病率高。柯志勇等⑻用此法研究时FGR发生率为42.12%。低氧法：低氧吸入可造成母体组织缺氧，可能影响胎盘血液供应等使胎儿生长发育不良。制造低氧IUGR模型所用氧气浓度有10%、14%和17%［9］，持续时间长短不一。血小板活化因子(plateletactivatingfactor,PAF)法：Thaete［10］采用给妊娠期的母鼠输入外源性血小板活化因子的方法建立了大鼠的FGR动物模型。该研究同时发现，孕鼠血液中血小板活化因子水平的升高和FGR发病的严重情况存在一定的剂量-效应关系，即在一定限度内，随着血小板活化因子剂量的加大，仔鼠体重减低更明显。但血小板及其活化因子在FGR发病中的具体作用及其相关机制尚不清楚。在上述模型中，用得最多的是动脉结扎法和营养干预法，限制蛋白质方法在国内应用较少，主要是因饲料合成技术达不到要求。改良的子宫动脉结扎法使用频率也较高，但手术对对照组母体和胎儿的影响大，对照组的出生体质量相对较轻。吸烟法主要是国内研究者使用，国外报道少。更生霉素是一种细胞毒性药物，其毒副作用影响该种模型的广泛应用。低氧模型在制作低氧环境时要求较高，需要特殊的设备，使用也受到限制。血小板活化因子法的机制尚不明确，仍需进一步研究。(二)脑损伤模型1.脑白质损伤模型基于PVL的主要病因［11］,脑白质损伤动物模型一般分为3大类：缺氧缺血模型、宫内感染/炎症反应模型和兴奋毒性模型。1.1缺氧缺血模型：常见的模型动物有大鼠、绵羊、兔。最常见的是对生后1-5d的新生大鼠进行单侧或双侧颈总动脉结扎，术后合并或不合并吸入低氧造模［12-⑸；单侧结扎术多合并吸入5.6%-8%氧气2-4h，双侧结扎术多合并吸入6-8%氧气30-60min。其次，可采用子宫内缺血再灌注法，即对孕兔进行暂时性子宫动脉血流阻断［16］;或直接对胎羊进行颈动脉血流暂时性阻断造模［17］。近年来有学者利用3硝基丙酸(3-nitropropionicacid,3-NP)脑内注射模拟缺氧造成脑白质损伤［18］。3-NP是一种线粒体毒素，它不可逆的抑制琥珀酸脱氢酶活性（复合体II）和三羧酸循环，破坏氧化代谢，造成组织缺氧，从而模拟缺氧效果。1.2宫内感染/炎症反应模型：常见的模型动物包括大鼠、兔和绵羊，造模方法包括脑内和子宫内注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）或细菌、病毒回2】］。由于LPS容易获得，不含杂质，目前多采用LPS造模。1.3兴奋毒性模型：常见的模型动物为大鼠和小鼠，采用脑内注射谷氨酸盐类似物鹅膏蕈氨酸（ibotenateacid,IA）或S-bromowillardiine造模［22］,前者作用于大脑内NMDA和代谢型受体，而后者则作用于AMPA和红藻氨酸盐受体。在缺氧缺血模型中以单侧或双侧颈总动脉结扎合并或不合并缺氧最常用，单侧颈总动脉结扎合并缺氧方法操作简单，可重复性好，病死率低，但由于单侧大脑半球病变不利于进行神经行为学实验，故可用于自身对照；双侧颈总动脉结扎合并或不合并缺氧术后大鼠体重和脑重增长幅度均低于对照组，同时脑白质逐渐出现疏松变，小胶质细胞增生，后期发生液化性坏死灶、双侧侧脑室扩大，更适于进行神经病理学研究以及药理学研究。采用3-NP脑内注射模拟缺氧的方法操作简单，可重复性好，病死率为零，但病变部位局限在注射部位附近，不能模拟脑白质弥散性病变，其应用前景仍需进一步观察。宫内感染/炎症反应模型无论脑内注射还是宫内注射LPS均可造成与人类相似的脑白质病变，且其实验动物的病死率较缺氧缺血模型低。但是，Poggi等［23］采用孕15d的Fischer334大鼠子宫颈内注射LPS1mg/kg造模，胎鼠出生后对其进行神经行为学观察，发现无论出生体重、反射、随意运动等与对照组均无明显差异，而神经病理学检查有明显的脑白质损伤。Roberson等［24］采用生后2~6d的Fischer334大鼠脑内注射LPS30〜120“g/kg从注射后至生后21d及生后8周对其进行神经行为学观察与对照组无明显差异，而免疫组织化学检查提示脑白质损伤。说明单独使用LPS对大鼠造模有局限性。兴奋毒性模型是以化学损伤模拟人类脑白质病变，不符合早产儿PVL的自然病理过程，但其操作简单，病死率低，多以小鼠作为模型动物，价格经济，有利于进行药理学研究，对进一步发掘PVL的治疗方法有很大的帮助。新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemicencephalopathy,HIE）模型Yagar等［25噌在2004年做过统计，在200多种新生丿儿HIE相关动物实验中，大鼠应用最广泛（29%）,接着是猪（25%）和羊（20%）。在这些动物模型中新生大鼠被研究应用的最广泛，但是与脑白质损伤动物模型不同的是，HIE模型动物日龄的选择7日龄的大鼠进行实验，此阶段大鼠的大脑皮层神经分层完整，少突胶质细胞已发育成熟，白质已有髓鞘形成，缺氧缺血损伤主要作用于神经元细胞，造成患侧的大脑皮层变薄，神经元坏死，与HIE的病理改变相符。2.1经典法：Vannucci等［26］对生后7d大鼠麻醉后行左颈总动脉结扎术，术后恢复4〜8h后置于氧浓度为8%的密封容器中持续缺氧3.5h。该方法容易实施，在血流变化及细胞代谢紊乱等方面与出生时窒息情况很相似。新生猪由于其脑发育成熟度接近新生儿，是近年来采用较多的制备iIBD的动物模型。常用的方法是呼吸机辅助通气吸入低浓度氧造成缺氧，合并双侧或者单侧颈动脉结扎造成缺血［27］。其优点是:（1）生后7d新生猪的脑发育成熟度与足月新生猪接近；（2）除了研究急性缺氧造成的脑损伤外，也能研究缺氧后中枢神经系统的远期预后及神经行为的改变；(3)由于新生猪体格相对较大，适合研究缺氧后的多脏器损害。2.2局部短暂脑缺血及再灌注法：Sola等爭］对生后7d大鼠麻醉后电凝左侧大脑中动脉，再用夹子夹毕左侧颈总动脉lh造成大脑局部缺血，lh后去除夹子，使左颈总动脉再通，从而诱导再灌注形成。该模型的诱导过程与新生儿HIE的发病过程相似［29］，主要用于研究暂时性缺血诱导的单纯缺血(没有缺氧)及再灌注损伤对新生鼠大脑的影响。2.3宫内缺氧缺血法：一种是对胎羊注射NO合酶抑制剂导致胎羊缺氧［30］；另一种是阻断胎羊脐带⑶］从而造成胎羊宫内缺氧缺血性脑损伤；还有向孕兔输7%二氧化碳的氮气10min使其窒息后剖宫迅速取出新生兔的方法［32］。经典法模型只结扎一侧颈总动脉，仅引起单侧大脑病变，而不能使全脑及全身其他系统一同受损，因此不能造成临床上严重窒息后引起多器官损害，有一定局限性。应用胎羊宫内缺氧的方法可获取丰富的神经生理学相关资料，适用于急性及亚急性的生理及代谢机制的研究，但是操作复杂，价格昂贵；而使孕兔缺氧的方法操作简便易行，但是模型的可靠性仍待进一步验证。胆红素脑病模型经典的方法是1997年，国内学者陈舜年等［33］建立的新生豚鼠经腹腔注射胆红素溶液制作胆红素脑病模型的方法；后来也有学者采用大鼠、仔兔经腹腔注射胆红素溶液制作胆红素脑病模型［34］。但是由于血脑屏障功能状态的影响，该方法引出异常神经行为活动及脑组织黄染现象的稳定性欠佳。近年来有学者采用新生大鼠小脑延髓池注射胆红素溶液的方法制作胆红素脑病的动物模型［35］。该方法受血脑屏障功能状态的影响较小，可更直接地研究胆红素的神经毒性。(三)肺部疾病模型肺出血模型司徒勋等［36］通过外源性五羟色胺(5-HT)气管滴入建立新生大鼠肺出血模型，浓度以1X10-5mol/mL较为适宜。模型制作简便，重复性好，其中弥漫性肺出血占10%~15%。研究者认为肺出血可能为5-HT气管滴入后导致急性缺氧，诱导内皮素-1(ET-1)分泌所致，因为ET-1参与肺动脉高压形成及增加毛细血管通透性，内源性ET-1的升高是导致肺出血的重要原因。陈克正等［37］用低温加缺氧建立低温、缺氧两种病因引起肺出血的动物模型；李娟等［38］用高分子右旋糖酐静脉注射建立高血粘滞征引起肺出血的动物模型；吴春英等［39］用肾上腺素皮下注射法，模拟临床先天性心脏病，超量输液致严重肺血管充血，建立幼龄大鼠肺出血模型；杜悦等［40］用内毒素腹腔注射建立感染引起肺出血的动物模型。新生儿肺出血与多种因素有关，以上方法均是针对某一种因素来造模，均有一定的局限性，需根据实验目的来选择相应的造模方法。胎粪吸入综合症模型(meconiumaspirationsyndrome,MAS)将人类胎儿胎粪经气管导管注入10-12d仔猪肺内或是成年兔的肺内［4142］。方法简便，可出现明显的肺损伤及全身炎症反应，但是不能完全模拟胎粪吸入综合症所导致的肺动脉高压等表现，有一定的局限性。新生儿呼吸窘迫综合症模型(respiratorydistresssyndrome,RDS)由于需要气管插管机械通气，通常采用兔、绵羊及灵长类动物等体型较大的动物作为模型动物。一般在妊娠时间达到总妊娠时间的85-90%行剖宫产手术取出胎兔、胎羊或胎猴的方法得到RDS模型［43-45］。支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia,BPD)模型将新生大鼠或小鼠持续暴露于高氧环境中(70-90%)数天［46,47］，出现肺损伤的病理形态学变化类似于新生儿BPD，可作为研究BPD的动物模型。还有国外学者采用基因敲除小鼠造模，以了解某一细胞因子对于BPD发病的作用［48］。(四)坏死性小肠结肠炎(necrotizingenterocolitis,NEC)模型最常用的模型动物是大鼠、小鼠和猪。大鼠是目前最常用的建模动物，它属“晚期发育模式”动物，足月出生时胃肠道等各方面的发育尚不成熟，可用于模仿早产儿建立NEC模型［49］,另外大鼠NEC模型在病理变化、临床表现及生化反应方面与人较接近。小鼠由于遗传背景清晰，主要用于基因学方面的研究。猪与啮齿类动物相比，在解剖结构、生理特性及物质能量代谢等方面更接近于人，它的肠道发育过程和人相似，均在胚胎后期就已经发育得比较成熟［49］。另外新生猪的体积较大，便于研究者对其进行手术和采血等操作。但猪的孕期及生长周期较长，价格也相对昂贵。缺氧-复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)法：利用H/R建立动物NEC模型是最先出现并曾广泛应用的方法［50‘51］。Gellen等㈤］证实窒息可使新生猪肠系膜血管及腹主动脉收缩，血流量减少，肠道水肿坏死，窒息组新生猪回盲部绒毛、隐窝及肌层的损伤与正常组相比有统计学意义(P<0.05)。但随着研究的深入，越来越多的学者否定了这种单因素的造模方法，Calpan等Q］报道了单纯窒息的新生大鼠并未出现腹胀、腹泻及便血等典型NEC表现，镜下回肠绒毛排列整齐或仅顶部稍微受损隐窝及肌层等结构完整。Sangild等［53］证实了H/R并非NEC的主要病因，只需给予人工喂养就能使57%的早产猪仔出现类似NEC的症状，肠道绒毛高度、酶活性及抗氧化能力也均降低。另外，临床上发现围生期窒息并不会引起NEC发病率的增高，两者无必然联系。因此，用H/R造模虽然简便，但很少出现典型的NEC症状及肠道病理变化，亦不能模仿NEC的复杂病因，现已很少使用。缺血-再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)法:主要是采用肠系膜上动脉结扎法°Papparella等［54］证实I/R组的新生猪活动减少，出现腹胀，镜下回肠黏膜及黏膜下层出现充血、水肿及坏死。Crissinger等［55］对新生猪实行肠系膜上动脉结扎(I/R各60min)后发现，虽然其肠道通透性增大，51Cr-EDTA清除率明显增加，但并未引起明显的肠道出血坏死。Chan等区］也证实单纯I/R(I/R各120min及25min)后早产鼠和足月新生大鼠并未出现腹胀、，单纯的I/R对肠道的损伤往往是一过性的，持续时间较为短暂，较少导致典型的NEC，因而这种方法的科学性受到质疑，应用受限。注射各种炎性介质:多年来已经成功通过注射LPS、PAF和TNF-a建立大鼠和新生猪的NEC动物模型，但发现所需的剂量均较大，因此更多的是综合运用LPS+PAF或LPS+TNF-a来建模，各介质之间具有协同作用，用量小且效果好。建模后动物出现呼吸促、腹胀、腹泻及便血等表现，肠道出血坏死程度也较重［57,58］。运用炎症介质建立的动物模型有其可取之处。首先，注射炎症介质造成的动物肠道损伤与人接近，病变确切且程度较重；其次，与NEC患儿在某些方面颇为相似［59,60］。但是这种方法也存在很大的缺陷:(1)NEC的真正病因并非炎症介质，而是各种病因导致炎症反应所形成的中间产物。(2)炎症介质会造成内毒素血症，出现多器官广泛病变，影响对NEC的特异性研究。(3)其病变好发部位与NEC患儿不同，常发生于空肠，结肠和直肠并不受累。早产+窒息+冷刺激+人工喂养:Barlow等首次应用人工喂养+窒息+细菌定植的方式建立了新生大鼠的NEC模型，而Caplan等^］则在此基础上用早产大鼠代替足月新生大鼠，3d后此模型出现腹胀、腹泻及便血等典型的NEC症状，回肠均出现不同程度的绒毛脱落、坏死，肠腺缺失，肠穿孔等病理改变。同时还发现人工喂养+窒息组与人工喂养+窒息+细菌定植组造模效果并无明显差别，证实了是否直接给予细菌定植并不影响造模效果。随着近年来的逐渐完善,早产大鼠+窒息+冷刺激+人工喂养已成为最常用的NEC动物模型［61］。与上述其他单因素造模方法相比，此法所建模型不仅可重复性高，临床表现及病理变化典型，更主要的是成功模拟了临床上NEC的多致病因素。这种方法也有一定的局限性，早产或新生鼠的肠道基本无菌群聚集，而新生儿发生NEC时肠道却已布满了各种菌群，两者在肠道内环境方面有所不同，另外此模型需要频繁的插管(3〜4h1次)也增加了建模的难度。(五)新生儿视网膜病(retinopathyofprematurity,ROP)模型氧诱导视网膜新生血管模型(oxygen-inducedretinopathy,OIR)是研究视网膜新生血管性疾病的常用动物模型［62］,将出生后第7天的C57BL/6J小鼠置于体积分数75%±2%的高氧环境中继续饲养5d，再置于普通空气中继续饲养5d,即可成模。该建模方法具有简便、快捷、结果可靠、重复性强等特点，经过近年来的发展，已成为应用最广泛的建立ROP或视网膜新生血管动物模型的方法。与其他建模方法ma］相比，具有简单、稳定和成模率高的优点，先后有大鼠、犬、猫和小鼠等成模的报道［65-71］。小鼠遗传背景明确，OIR新生血管发生率高达100%a］。选择C57BL/6J新生小鼠作为研究ROP的动物模型的原因：(1)正常小鼠的视网膜血管在生后2周内开始发育并成熟，这就能观察到视网膜血管发育的全过程；(2)新生小鼠视网膜血管的发育阶段相当于人类胎儿孕4〜5个月时的表现；(3)生后第7天新生小鼠视网膜血管发育最接近人类早产儿视网膜血管的特点，因为它的玻璃体动脉退化的程度最大，视网膜血管发育的程度最小，暴露于75%的高氧中第5天后，可产生能定量研究的视网膜新生血管，且该方法重复性极高。Smith等［7011994年首先建立小鼠OIR模型，接近人类早产儿视网膜病变的病程。但是如果将小鼠暴露于80%以上的高氧中，虽然视网膜的新生血管化有轻度的增加，小鼠的死亡率明显上升，部分可能是由于母鼠死亡率明显上升所致，所以选择75%的氧浓度作为高氧。总之，理想的动物模型除在病因、病理、生化及临床表现等各方面与人相似外，还要求其建模周期较短、可重复性强、建模方法简单易行且成功率高。每一种动物模型均有其优缺点，必须结合研究的目的选择合适的模型。此外还需注意遵循“3R”原则：Reduction（减少）、Replacement（替代）和Refinement（优化），必须获得伦理委员会的批准方能进行动物实验。参考文献颜耀华，李力，俞丽丽，等.阻断子宫动脉建立FGR大鼠模型的研究.中国实验动物学报,2007,15:44—45.潘石蕾，余艳红.一种新型胎儿宫内生长迟缓大鼠动物模型.第一军医大学学报,2002,4:339-343.HagashiT，DorkoME.Aratmodelforthestudyofintrauterinegrowthretardation[J].AmJObstetGynecol，1988,158:1203.GallerJR,TonkissJ.PrenatalproteinmalnutritionandmaternalbehaviorinSprague-dawleyrats.JNutr,1991,121:762-769.SusanE,Ozanne.Metabolicprogramminginanimals.BrMedBull,2001,60:143-152.Fernandez-TwinnDS,OzanneSE,EkizoglouSC,etal.Thematernalendocrineenvironmentinthelow-proteinmodelofintra-uterinegrowthrestriction.BritishJNutrit,2003,90:815-822.周根来，陈才勇，王恬.胎儿宫内发育迟缓的实验动物模型.中国比较医学杂志,2003,13:117-118.柯志勇,刘军,丘小汕.三种宫内发育迟缓大鼠模型方法的比较.中国当代儿科杂志,2000,2:24-26.ParimiPS,CronigerCM,LeahyP,etal.EffectofReducedMaternalInspiredOxygenonHepaticGlucoseMetabolismintheRatFetus.PediatrRes,2003,53:325-332.ThaeteLG,NeerhofMG,JillingT,etal.Infusionofexogenousplatelet-activatingfactorproducesintrauterinegrowthrestrictionintherat.JSocGynecolInvest,2003,10:145一150.沙彬,周文浩.早产儿脑室周围白质软化与少突胶质细胞损伤机制.中国新生儿科杂志,2008,23:57-60.McQuillenPS,SheldonRA,ShatzCJ,etal.Selectivevulnerabilityofsubplateneuronsafterearlyneonatalhypoxia-ischemia.JNeurosci,2003,23:3308-3315.MizunoK,HidaH,MasudaT,etal.Pretreatmentwithlowdosesoferythropoietinamelioratesbraindamageinperiventricularleukomalaciabytargetinglateoligodendrocyteprogenitors:aratmodel.Neonatology,2008,94:255-266.UeharaH,YoshiokaH,KawaseS,etal.Anewmodelofwhitematterinjuryinneonatalratswithbilateralcarotidarteryocclusion.BrainRes,1999,837:213-220.LinS,RhodesPG,LeiM,etal.alpha-Phenyl-n-tert-butyl-nitroneattenuateshypoxicischemicwhitematterinjuryintheneonatalratbrain.BrainRes,2004,1007:132-141.DerrickM,LuoNL,BregmanJC,etal.Pretermfetalhypoxia-ischemiacauseshypertoniaandmotordeficitsintheneonatalrabbit:amodelforhumancerebralpalsy?JNeurosci,2004,24:24-34.RiddleA,LuoNL,ManeseM,etal.Spatialheterogeneityinoligodendrocytelineagematurationandnotcerebralbloodflowpredictsfetalovineperiventricularwhitematterinjury.JNeuro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