黑素皮质素受体-4与瘦蛋白调控肥胖的研究进展

黑素皮质素受体-4与瘦蛋白调控肥胖的研究进展

mc4r（melac-4receive，黑素物质受体-4）是脑实质中从黑素物质中排出的一个个体物质。这是黑素受体家族的五个亚型（mc1-5r）之一。黑素皮质素受体是G-蛋白偶联受体(G-proteincoupledreceptors,GPCRs)超家族的成员,是腺苷酸环化酶途径中所有的7个横跨膜受体,它们的表达部位和功能都不一样。MC1R基因被毛色扩展基因座所编码,在黑素细胞和白细胞中表达,分别影响毛发、羽毛及表皮色素沉积和炎症的发生。MC2R仅在肾上腺皮质和脂肪细胞中表达,其功能是作为促肾上腺皮质素的受体,介导肾上腺类固醇生成。MC3R是一个神经受体,主要生理功能是调节采食行为和能量平衡,对动物体重有显著影响。MC4R可与脑部分泌的天然内源配体α-促黑激素(alphamelanocyte-stimulatinghormone,α-MSH)结合,抑制体重的增加。在哺乳动物中,MC4R具有介导瘦蛋白(leptin)的功能,是一个调节能量平衡与能量动态平衡的重要信号分子。MC4R可与其内源性配体黑素皮质素激素(melanocortin,MC)或刺鼠色蛋白(agoutiprotein,agouti蛋白)和agouti相关蛋白(agoutirelatedprotein,AGRP)相结合,从而在控制食欲和体重稳态中起关键作用。MC4R的中枢神经体重调节功能主要为抑制摄食,导致血糖、胰岛素和瘦素水平降低,从而减少体脂,降低体重。因此,在人类肥胖研究中MC4R作为重要的调节因子倍受关注。最近有研究表明:MC4R的1232位点的G→A的突变与绵羊背膘厚度间存在关联,AG和AA型较GG型具有较高的背膘厚度。1mt4r分子模型MC4R由332个氨基酸残基组成,是跨膜G蛋白耦联受体家族的成员之一,具有7次跨膜结构。其蛋白的N-末端在细胞外、C-末端在细胞内,每两个跨膜区形成一个拌区,MC4R的结合区在跨膜区,通常在第3~5和第7跨膜段内。跨膜区是相当保守的,在同一类受体中几乎是相同的。研究表明,N-末端和C-末端的第3跨膜段和第2个胞内拌区是与G蛋白发生作用的重要位点。在第2、第3胞内环(C2、C3)和羧基末端存在蛋白激酶作用的磷酸化位点。Lagerstrom等发现MC4R在TM2和TM3之间可以插入金属锌,这和其他GPCR相似;通过他们创造的MC4R分子模型发现TM3的旋转对于MC4R的功能是重要的。结合位点的改变或氨基酸残基的不同可能引起MC4R功能的改变。MC4R大量存在于动物中枢神经系统的各个区域中,包括大脑皮质、丘脑、下丘脑、脑干和脊索。1994年,Mountjoy等通过原位杂交技术发现大鼠脑内MC4R在下丘脑腹内侧核(VMH)和弓状核、中央隆凸和内侧系带核高密度分布,而在下丘脑背内侧核和大脑前区的分布密度较低,通过限制摄食可上调上述部位MC4R密度,而通过摄食诱导肥胖可下调受体密度。可见,MC4R是神经组织特别是下丘脑中占优势的受体亚型,因此它被认为在下丘脑食欲控制过程中起关键作用。2黑素皮质素受体-4mc4r的监管机制2.1小鼠侧脑室-msh和mc4r的相互作用黑素细胞皮质激素(melanocortin,MC)是α-黑素细胞刺激素(α-melanocytestimulatinghormone,α-MSH)、β-MSH、γ-MSH和ACTH等相关肽的总称,是由大分子多肽前体物质———前阿片黑素细胞皮质激素(proopiomelanocortin,POMC)水解后生成的。在小鼠侧脑室中注入α-MSH及其同类物MT-Ⅱ(MC3R和MC4R的强激动剂),可抑制正常空腹和神经肽Y(NPY)刺激时的小鼠摄食量增多,也可抑制agouti过度表达和ob/ob(缺少瘦素)肥胖小鼠的摄食。同时使用α-MSH的拮抗剂SHU9119,则动物的摄食量明显增加。在小鼠侧脑室内注入SHU9119,也可增加其夜间的摄食和空腹的摄食量。对于剔除MC4R基因的小鼠,对抑制食欲的激动剂MT-Ⅱ则无反应,证实了内源性MSH对摄食的调节作用是经由MC4R实现的。因α-MSH和MT-Ⅱ皆为非选择性MCRs的激动剂,Stephen等使用新的选择性MC4R激动剂Ro27-3225,并且为了防止其他的、非特异性的代谢影响,如胃病,采用了对厌食结果敏感的行为检测,发现大鼠和肥胖db/db小鼠都产生了摄食的剂量依赖性,进一步证实了MC4R在食物摄取和体重控制方面的重要性。2.2mc4r缓冲2.2.1wmonusoperia型的sossyndrose而非高效刺鼠色蛋白因一种金黄色皮毛的小鼠而得名,这种小鼠除了皮毛颜色呈金黄色外,10~12周会出现代谢异常,摄食量增加,血糖升高,血清胰岛素水平上升,体重增加,并逐渐肥胖,形成小鼠的黄色皮毛肥胖综合征(theyellowmouseobesesyndrome),亦称Agouti肥胖综合征。直至1992年,agouti基因被克隆,人们才清楚了其变化的原因。若agouti基因发生突变,基因结构部分删除或插入于野生型agouti基因的编码序列,产生6种显性agouti等位基因(Ay、Avy、Aiapy、Ahvy、Asy和Aiy),Raly启动子占优势,这样agouti于全身广泛表达,拮抗α-MSH和MC1R的结合,导致合成脱黑素(pheomelanin),动物皮毛变黄色;拮抗α-MSH与下丘脑摄食中枢中MC4R的结合,使小鼠的摄食量比对照组增加10%~36%,产热减少,对热卡的利用率上升,并逐渐肥胖(肥胖主要是由于脂肪细胞的增大),体长也增加。2.2.2胞前体保护的agrp作用AGRP(agouti相关蛋白)是aguoti的同类物,是MC4R的内源性抑制剂,可竞争性拮抗α-MSH对MC3R和MC4R的作用(对MC5R作用很弱),从而增加食欲和摄食量。Yang等通过替换MC1R(AGRP非抑制受体)和MC4R的1、2、3胞外环的氨基末段,检测cAMP后证实2、3胞外环为AGRP结合部位。Carrie等首次认为AGRP除了可以竞争性拮抗α-MSH,还可以直接与MC4R作用,是MC4R的逆向拮抗剂。转基因AGRP过度表达的动物,在β-actin启动子控制下,肥胖,体长增加,胰岛增大,产生高胰岛素血症和延迟发生的血糖升高;皮毛的颜色没有变化,这是因为AGRP作用于MC4R和可能还有MC3R,而不作用于MC1R的缘故;糖皮质激素的水平,同agouti广泛表达的动物一样,无明显的变化。近来,使用具有对MC4R更强选择性的拮抗剂(如HS104和HS024)增加了饱食大鼠的白昼摄食量,如长期在脑室内注入这两种拮抗剂,随着摄食量的增加,大鼠的体重逐渐增加而致肥胖。在MC4R调控的研究中,Oosterom等发现268位密码子Tyr决定了激动剂与拮抗剂的共同选择性。3mc4r基因在细胞、动物及鼠体内的分布MC4R基因突变在介导肥胖症发生中的作用越来越受到人们的关注。理论上认为MC4R基因的突变引起的肥胖症是由于单倍体不足、显性负性效应、或者两者的联合作用。现在各物种关于MC4R基因的研究已经全面展开,并取得了丰硕的研究成果。1993年,Gantz等成功克隆出MC4R并将其定位于人染色体18q21.3。人类MC4R编码基因是一个由996个碱基对构成的单一外显子。随后,小鼠、大鼠、猪、鸡、牛等MC4R基因也相继被克隆。MC4R基因在各物种中具有高度的同源性。Haegeman等在克隆牛MC4R基因的同时发现,牛与人、猪、鼠MC4R基因序列相比较,同源性分别为87%、89%和85%。基因的高同源性提示MC4R基因及其表达产物功能的高度保守。3.1mc4r基因突变MC4R是第一个发现的与人类显性遗传疾病性肥胖相关的靶位点。Yeo等和Vaisse等首次在两例早发性肥胖患者中发现了MC4R基因移码突变后,MC4R在人类能量和体重调节中的重要性逐渐地被揭示。人MC4R突变研究表明,其显性遗传多由于单体不足所导致,在极少数个体中也可出现隐性遗传的错义突变。MC4R基因突变属常染色体显性遗传,因此该基因具有表型的突变在人群中的发生率较高,迄今有近80例MC4R基因突变导致肥胖的病例报道,据估计BMI大于40的极度肥胖人群中有1%~4%是由于MC4R基因突变所致。在人类由MC4R基因突变引起的肥胖症其表现型多种多样,除了多食、肥胖外,并不伴发其他的内分泌代谢异常,甲状腺、肾上腺和生殖功能正常,不同于其他类型的单基因突变性肥胖。另外,MC4R基因多态性也可能与体脂分布及脂代谢相关,体型缺陷MC4R导致的肥胖为青少年发病型,且女性的严重程度高于男性,其中大多数患者体脂分布有女性化倾向。Rosmond等在瑞典人群中的研究表明,MC4R基因Vall03Ile多态性与腹内脂肪、胰岛素水平、血糖水平及脂代谢水平相关。3.2正常大鼠mc4r+/-大鼠mc4r+/-大鼠mc4rHuszar等(1997)首次证明了MC4R在能量平衡中的关键作用,即敲除MC4R基因(MC4R-/-)的小鼠出现遗传性肥胖,表现多食、肥胖、胰岛素分泌过多等症状。具体为第15周时(MC4R-/-)雌性大鼠为同胞正常大鼠MC4R+/+体重的2倍,而雄性则为1.5倍,杂合子MC4R+/-大鼠的体重改变介于MC4R-/-与正常大鼠之间。同时,在敲除小鼠中,高血糖和高胰岛素的水平与性别有关,两种情况下雄性比雌性形成更快。3.3mc4r基因多态性分布猪MC4R基因物理定位于1号染色体q22~27处,与猪1号染色体上的数个标记明显连锁,用两点连锁分析得到的两个离MC4R基因最近的连锁标记是SO3113(0,17.76)和S0082(0.05,14.74)。Kim等通过序列比较分析,发现猪MC4R基因第7跨膜结构功能域的一个高度保守区内一个突变(G→A)导致相应的第298位氨基酸发生了天冬酰胺代替天冬氨酸的错义突变,并建立了TaqI-PCR-RFLP鉴别猪MC4R基因型方法。对PIC公司5个系的商品猪共1800头进行分析,显示MC4R基因型与一些品系的背膘厚和生长率以及所有品系的采食量呈强相关,AA基因型背膘比BB基因型薄9%,BB基因型比AA基因型日增重高37g,且差异显著(P<0.05)。柳丽华等利用PCR-RFLP方法对野猪、杜洛克猪、长白猪,及野猪与杜洛克猪的杂交后代、野猪与长白猪的杂交后代5个群体242头猪MC4R基因的遗传变异进行了研究,发现MC4R基因扩增位点存在TaqⅠ多态性,不过野猪、野猪×长白猪未出现AA基因型,所有群体中C等位基因均以较高频率存在,野猪最高(0.9167),长白猪最低(0.5283)。赵晓枫等应用PCR-RFLP方法对金华猪I系(154头)、金华猪II系(41头)、金华猪III系(53头)的MC4R基因的1269~1494bp区段进行扩增,并用TaqI酶进行酶切,比较了MC4R酶切后基因型频率分布情况,结果表明,AA基因型频率在金华猪上较高,达0.9194,在II系中最高,达0.9512,III系次之,达到0.9434,I系最低,达0.9026,而金华猪的AB基因型和BB基因型频率都较低,分别为0.0565和0.0242。杨晓慧等采用PCR-RFLP技术对MC4R基因的298位点错义突变(Asp298Asn)在莱芜猪、大莱二元杂交猪和商品猪中的多态性进行了检测,对该突变与商品猪背膘厚的关系进行了关联分析。结果表明,在33头莱芜猪中只检测到11个基因型,而在大莱二元杂交猪和商品猪中11、12和22基因型均有分布,且等位基因1的频率均高于等位基因2。商品猪不同基因型个体背膘厚差异显著(P<0.05),MC4R基因298位点的Asp298Asn错义突变与商品猪的背膘厚有关,可以作为以西方猪种为杂交亲本的商品猪背膘厚的分子标记。额尔敦达古拉(2009)采用PCR-RFLP技术对大白猪、北京黑猪及莱芜猪MC4R基因D298N突变位点进行了多态性分析,结果发现:大白猪(引入品种)和北京黑猪(培育品种)含D298N位点等位突变所以瘦肉率高,肌内脂肪含量低。MC4R基因D298N突变位点很可能与肌内脂肪含量相关。以上研究表明MC4R可以作为与猪脂肪沉积性状及肉质性状相关的候选基因。3.4mc4r基因多态性与体重相关性研究巴彩凤等成功构建了犬MC4R原核表达载体,此重组体能在E.coliBL21内表达犬MC4R融合蛋白,为进一步获取犬MC4R的单克隆抗体奠定了物质基础,也为研究犬MC4R蛋白的结构和生理功能提供了帮助。张轶博等分析了比格犬黑素皮质素受体-4基因多态性与犬体重的关系,结果在比格犬MC4R基因中发现2处单碱基缺失突变,1个单碱基颠换变异,存在PshAⅠ酶切位点,并基于PshAⅠ酶切位点建立了PCR-RFLP技术。统计分析显示犬MC4R基因型与体重显著相关,可以考虑将MC4R基因作为犬体重的候选基因。巴彩凤等克隆了犬MC4R基因片段,并寻找其多态性位点,结果发现锦州本地犬MC4R基因片段有2处A碱基缺失突变。表明本地犬中存在MC4R基因的多态性。3.5mc4r基因在京海黄鸡群体中的多态性李国辉等利用PCR-SSCP和DNA测序的方法,对京海黄鸡鸡群MC4R基因多态性进行了分析,发现存在2个单核苷酸多态位点,分别为第662位碱基G→C点突变和第733~734位碱基间插入一个C碱基。陶勇等以140只京海黄鸡为试验材料,以MC4R为候选基因,采用PCR-SSCP和DNA测序技术分析了MC4R基因在京海黄鸡群体中的多态性。结果表明:MC4R基因编码区第662bp处有G→C碱基的点突变,在京海黄鸡中检测到AA、AB、BB三种基因型,由此推测,MC4R基因可能对于鸡生长性能具有很大的影响或与控制生长性能的主基因连锁。霍明东等以高低脂双向选择肉鸡品系为研究材料,采用PCR-SSCP和测序方法检测MC4R基因编码区的SNPs,结果在编码区发现1个G315T的突变。推测MC4R基因可能是影响鸡早期生长和肌肉性状的主效基因或与主效基因相连锁。仇雪梅等利用PCR-SSCP和DNA测序的方法,对资源家系F2代鸡群MC4R基因多态性进行了分析,发现存在4个单核苷酸多态(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)位点。表明MC4R基因可以作为影响和控制鸡体重、生长等屠体性状的主要候选基因。3.6mc4r基因的突变及其定位Haegeman等对牛的MC4R基因的cDNA进行了克隆并测序。结果表明,在DNA水平上,牛的MC4R基因与人、猪、鼠的同源性分别达到87%、85%和89%,在蛋白质水平,同源性都超过90%。通过单链构象多态性(SSCP)发现有2个核苷酸发生改变:T和G分别被替换成C和A,保守的缬氨酸被替换成丙胺酸(Val145Ala),丙胺酸被替换成苏氨酸(Ala172Thr)。Thue等通过对加拿大肉牛的遗传图谱研究,将牛的MC4R基因最终定位在牛的24号染色体上(BTA24)。张菊研究表明:MC4R的1232位点的G→A的突变与绵羊背膘厚度间