荧光定量pcr中荧光探针的研究进展

荧光定量pcr中荧光探针的研究进展

牛仔布斯特（pcr）是美国科学家在1983年开发的一种快速扩展的特定基因。它也是一种方法。进展最快、应用最广泛、简单的外部基因复制技术。PCR通过重复模板链变性,引物退火,聚合酶延伸3个步骤,对目的基因或基因片段进行扩增,理论上目的基因数量在每个温度循环后将增加1倍,经20次～30次循环后,被扩增的基因数可达106以上,其敏感性相当高,任何痕量样品都可得到扩增,因此被广泛应用于临床病原微生物的诊断领域。但由于其高度灵敏,在扩增时细微的条件变化都将影响扩增量和特异性,且任何DNA样品或所用试剂均有可能发生交叉污染,因此常规PCR在用于病原微生物诊断检测时存在不能准确定量,易交叉污染产生假阳性等局限。近年来将荧光共振能量传递技术应用于PCR,不仅提高了PCR的特异性,而且还能做到实时准确定量。当一个受激发的荧光素(供体)的能量转移到邻近的另一荧光素(受体),并不发射荧光而是受淬灭回到基态,这一现象就称为荧光共振能量传递(fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)。荧光能量转移效率与荧光分子和淬灭分子距离的6次方成反比。FRET与PCR结合用于对PCR产物的检测,不但可能提高检测的灵敏度,而且还能对PCR产物进行准确定量,提高其检测的特异性。目前,在兽医学领域荧光定量PCR主要用于动物传染病病原的定量检测。1发展荧光检测定量pcr技术1.1荧光淬灭分子检测TaqMan技术是PE-ABI公司开发的荧光定量技术,它利用了Taq酶的5′-3′外切酶活性,合成一个能与PCR产物杂交的探针,该探针的5′末端标记一个荧光分子,3′末端标记荧光淬灭分子。其中3′端荧光分子能够吸收5′端荧光分子发出的荧光,因此正常情况下检测不到该探针5′端荧光分子发出的荧光,但当溶液中有PCR产物(模板)时,该探针与模板结合,激活Taq酶的5′-3′外切酶活性,将探针5′端连接的荧光分子从探针上切割下来,加大了与淬灭分子的空间距离,摆脱了淬灭分子的荧光淬灭作用而发出荧光(图1),切割的荧光分子数与PCR产物的数量成比例。因此,根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。1.2淬灭探针反应Amplisensor探针是一种复合探针技术,互补的两探针,一探针5′末端连接一种荧光分子,另一探针3′末端连接淬灭分子。两探针长度不同,其中淬灭探针的5′末端多出7个碱基(GCGTCCC)。PCR扩增前需用连接酶将荧光探针与PCR半套式引物连接,半套式引物的5′末端应有一段与长探针互补的序列,以便连接酶将引物与探针连接。PCR扩增时探针一引物复合物中的代引物部分作为半套式引物优先参入到模板,从而释放出淬灭探针,破坏了FRET,荧光探针从而产生荧光,荧光的强度与扩增时加入的模板数成正比(图2)。可直接将半套式引物合成在荧光探针的3′端,省去了PCR扩增前的连接步骤。1.3探针与模板的杂交分子信标技术(molecularbeacon,MB)是一种设计巧妙的荧光探针,与TaqMan和Amplisensor探针不同,该探针5′末端和3′末端自身可形成8个碱基左右的发夹式结构使荧光分子和淬灭分子邻近而发生荧光淬灭,球环是特异的探针部分。当溶液中有特异模板时该探针与模板杂交,由于分子的刚性破坏了探针的发夹结构,即破坏了FRET,于是溶液便产生荧光(图3),荧光的强度与溶液中探针的杂交量(即模板量)成正比。后来,NazarenkoIA等在分子信标的发夹碱基末端直接连接上PCR引物,设计出一种发夹探针式引物(sunriseprimer),因此使所有的扩增产物均能标记上荧光分子,荧光信号响应快(图4)。WhitcombeD等在Nazarenko的基础上对发夹探针式引物进行了改进,发明了一种称之为蝎状引物(scorpionprimer)的荧光定量PCR技术,他在引物与分子信标探针之间连接一个间隔阻断臂,使PCR延伸反应时不能够延伸至信标分子,因此非特异扩增产物便无荧光信号,但当有特异扩增产物时分子信标即可与扩增产物进行分子内杂交,产生荧光信号(图5)。1.4荧光分子和淬灭分子的fret反应LightCycler是Roche公司开发的一种PCR定量技术,该技术是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同探针上,产生发光探针和淬灭探针,发光探针的5′末端连接荧光分子;淬灭探针的3′末端连接荧光分子。由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交,杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子便紧密相邻,从而发生FRET,使荧光淬灭(图6)。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比,以此可以进行PCR定量分析。1.5子信标荧光探针复合探针的结构复合探针(complexprobes)定量PCR技术是我国研究和开发的一种新型定量PCR技术,这种定量PCR技术综合了lightcyler技术和分子信标技术的优点,同时又克服了它们的不足之处。该复合探针由一条长的荧光杂交探针和短的淬灭探针构成,其中荧光探针5′末端接一荧光分子,3′末端接一延伸阻断分子磷酸,淬灭探针3′末端连接一个淬灭分子对甲基红,淬灭探针与荧光探针5′端互补,无模板时,该探针杂交形成复合探针,无荧光产生。当扩增过程中有靶基因时,在较高温度下荧光探针优先与模板结合,从而使两探针分离并产生荧光(图7),荧光强度与PCR体系中模板数量成正比,因此可对PCR产物进行定量检测。1.6探针的荧光淬灭作用原理孔德明等综合分子信标及TaqMan探针技术,设计了一种新型的均相荧光检测探针(TaqMan-MB)。该探针保留了分子信标的茎-环结构,从而保证了荧光分子与淬灭分子的荧光淬灭距离,当无靶序列时能有效地发挥荧光淬灭作用。但与常规分子信标不同的是,除球环部序列外,其5′端的碱基臂序列也设计为探针的基因识别部位。在PCR扩增的退火/延伸阶段,探针与模板上相应的靶基因位点特异性结合。同时,Taq酶随着引物的延伸沿DNA模板移动,当移到探针结合位置时,发挥其5′-3′外切酶活性,将探针切断,从而使荧光基团与淬灭基团彻底远离,荧光基团荧光复原。体系荧光信号自于探针与靶基因杂交时所引起的构象变化和探针的降解(图8),大大地增强了体系的荧光强度。2荧光定量pcr检测相对于人的疾病定量检测,荧光定量PCR技术用于动物传染病病原的定量检测步伐要慢得多,这并不是技术本身在检测动物疾病受到限制,而相对于人来说,动物本身的价值与技术成本存在一定的差距。但随荧光定量PCR技术的成熟和发展,对许多难培养或不能培养的动物传染病病原用荧光定量PCR技术进行诊断就简单易行,许多人畜共患传染病对人畜危害特别大,可用此技术。还有一般技术对疾病亚临床或潜伏感染的诊断显得无能为力,用荧光定量PCR技术对这些病进行诊断具有其独特的优势。目前,运用荧光定量PCR技术诊断动物传染病病原的报道也日渐增多。ThieryR等建立了检测PRV急性和潜伏感染猪三叉神经节中DNA的荧光定量PCR方法,其灵敏度达到5个PRV基因组拷贝数/106宿主细胞,且更适合于诊断低感染量的潜伏感染猪的PRV,比其他方法更加敏感、特异。BumsteadN等用荧光定量PCR检测鸡马立克氏病病毒,即可检测到组织样品中MDV的存在,而且可准确定量,比蚀斑测定省时省力。我国虽然有世界最好的猪瘟弱毒疫苗,但猪瘟仍然是我国猪病中的罪魁祸首,给养猪业造成了巨大的经济损失。常规方法很难区别隐性感染猪、带毒猪和弱毒免疫猪。陈玉栋等建立一种快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR技术,在猪瘟兔化弱毒疫苗株的5′端非编码区设计一对引物和一条荧光探针,利用LightCycler检测系统,首次建立了定量检测猪瘟兔化弱毒疫苗的方法。结果表明,该方法的灵敏度为100拷贝数,与兔体定型热反应有很好的相关性,整个检测过程仅需4h。该法可望取代传统的兔体定型热反应用于疫苗生产过程中的效价测定及指导疫苗的配制,也为猪瘟病毒分子生物学研究提供了一种新的、简捷有效的工具。鸭乙型肝炎病毒是造成鸭发病的重要病原之一,与人乙型肝炎病毒有许多相似点。陈压西等建立了鸭乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR方法,并用于鸭血清中病毒核酸的定量检测,取得很好效果。通过检测血清中肝炎病毒核酸的含量,可以分析病毒在体内的复制活动情况,从而为研究病毒性肝炎的发病机理,评价和预测抗病毒药物的疗效提供重要依据。鸡传染性法氏囊病病毒,猪肠道病毒等动物的其他病毒的荧光定量PCR检测也已报道。用荧光定量PCR检测对人畜危害大,而且培养困难的细菌,是此技术的又一大优势。弯曲菌被认为是人类主要食源性病原之一。由于空肠弯曲菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态,所以传统的生化鉴定结果并不一定可靠,并且是一项费时而繁琐的工作。阳成波等建立了一种基于TaqMan探针的实时定量PCR方法来定量检测空肠弯曲菌。该方法可在60min内完成,检测限度为5cfu。这种荧光定量PCR方法既为空肠弯曲菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法,又为研究空肠弯曲菌致病机理提供了一种重要的方法。引起莱姆病的伯氏疏螺旋体和引起各种动物发病的支原体都是不易在体外培养的细菌,荧光定量PCR可对这类细菌进行定量检测。StraubingerRK等设计与伯氏疏螺旋体特异性ospA基因片段互补的引物和荧光探针,用荧光定量PCR技术检测了从小猎兔犬皮肤提取的活组织样和血液样品中的伯氏疏螺旋体的特异性ospA基因。实时监测了小猎兔犬感染伯氏疏螺体后500d内从皮肤提取活组织的样品和血液样品中的螺旋体数量变化情况,并比较了抗生素治疗和未治疗对组织中病原体基因含量的影响。荧光定量PCR还可用于对伯氏疏螺旋体在野外蜱中的流行病学调查。鸡毒支原体、流产布鲁氏菌和炭疽杆菌等细菌的荧光定量PCR也已见报道。荧光定量PCR已用于寄生虫的检测和鉴别,PremanandhJ等用荧光定量PCR检测了马生殖泰勒虫,并用此法区别驴生殖道泰勒虫。荧光定量PCR在对有些寄生虫病的诊断和鉴别中显示出独特的优势。3其