香港海鸥形菌dna脉冲场凝胶电泳技术条件的探索

香港海鸥形菌dna脉冲场凝胶电泳技术条件的探索

香港的海鸥菌（lh）首次从香港来到国外，如yuen等人。血清型是细菌最基本的表型分型方法,目前LH缺乏血清分型,难以通过表型分析菌株间的关系,分子分型是其主要的分型方法。而脉冲场凝胶电泳(pulsed-field-gelelectrophoresis,PFGE)是近十年发展起来的一门基因分型技术,该法凭借其具有对细菌全染色体的整体分析、分辨率高、重复性好、结果稳定、易于标准化的特点,而深受研究者的青睐,目前已作为分子指纹图谱的“金标准”。更为重要的是,PFGE数据能够利用网络在各个实验室之间乃至全世界分子分型实验室之间的数据进行比对,实现资源共享,故备受各级实验室的重视,在分子流行病学研究中得到了广泛应用。虽然该方法在其它菌属中均有大量的数据报道,但香港海鸥形菌作为新发现的菌种,PFGE分型的数据只限于香港学者的报道,且报道欠缺详细,部分该技术的重要环节未见讨论,而中国大陆未见有相关的报道。通过本研究,探讨适用于该菌的PFGE分型条件,以更好地在该菌分子生物学水平上掌握和利用PFGE技术,为该菌的分子流行病学研究奠定基础。1材料和方法1.1大学生物学及酶学香港海鸥形菌模式株(HKU1)由香港大学微生物学系袁国勇教授惠赠;香港海鸥形菌人源株(人242)由杭州市疾病预防控制中心倪晓平教授惠赠。1.2蛋白酶和限制性内切酶低熔点琼脂糖、脉冲场级琼脂糖购自Bio-Rad公司;蛋白酶k购自Sigma公司;SpeI限制性内切酶购自TaKaRa公司。恒温水浴摇床、分光光度仪、脉冲场电泳仪、凝胶成像系统均购自Bio-Rad公司。1.3h组不同时间点土壤中h将鉴定分纯的香港海鸥形菌接种到LB,37℃水浴摇床培养24h;离心,弃上清,将沉淀的菌块悬浮于细胞悬浮液(CSB:1mol/LTris,0.5mol/LEDTA,pH8.0),制成浓菌液,将菌悬液的OD1.4核心消酸钠sds用细胞裂解液(CLB:1mol/LTris-CL,0.5mol/LEDTA,pH8.0,10%SDS,20mg/ml蛋白酶k)消化胶块;保证胶块浸泡在裂解液下,将离心管放入54℃水浴摇床中,分别孵育2h和4h,转速为170r/min。1.5充填液制备水浴盖将纯水和1×TE在54℃水浴中预热。去除裂解液后,加入与去除的裂解液等量的预热纯水,放入54℃水浴摇床中,转速为170r/min,洗栓10min,共洗2次;再用1×TE洗栓4次,每次15min。最后加入室温下1×TE,洗栓1次,室温静置2~3min。1.6spei缓冲液的制备从TE中取出胶块,刀片切下2mm大小的胶块,将胶块放入另一Ep管,加入200μlSpeI的缓冲液,37℃孵育5min。平衡后,吸出缓冲液后再加入250μl缓冲液和加入SpeI,浓度分别为20U、24U、30U,37℃水浴酶切20h。1.7抗起毛琼脂糖固定剂用0.5×TBE(Tri碱,硼酸,EDTA)制备1%脉冲场级琼脂糖,把110ml融化的琼脂糖缓慢倒入带梳子的胶槽,避免气泡产生。室温下凝固30min。拔出梳子,用铲把酶切好的胶栓加入上样孔,用2%低熔点琼脂糖封住胶孔。1.8电泳设计及方法调整电泳槽至水平位置,加入2.5LTBE(0.5×),关上盖子。打开主机和泵的开关,确保流速为1L/min。打开冷凝机,将温度设定在14℃。取出凝固好的胶,用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶,把胶放到电泳槽中,盖上盖子,分别设置电泳参数。电泳结束后,把胶块放入EB溶液中染色40min,然后用蒸馏水脱色30min,中间换水2次。用Bio-Rad脉冲场凝胶成像系统将染色后的胶在UV条件下曝光拍摄。2细胞裂解时间和spei酶切和电泳条件不改变时图像的特征经电泳和染色后,使用Bio-Rad凝胶成像分析系统拍摄LH在不同条件下的DNA指纹图谱。当OD值为1.6、细胞裂解2h、SpeI24U酶切20h、电泳脉冲时间为2.2~54.2s、脉冲角度为120°、电场强度为6V/cm、电泳25h时,图像模糊,基本上看不到酶切条带(图1A)。当OD值调整为1.8,细胞裂解时间、SpeI酶切和电泳条件均不改变时,图像仍模糊(图1B);当酶切条件调整为SpeI30U酶切20h、OD值为1.8,细胞裂解时间和电泳条件不改变时,得到的图像仍模糊不清(图1C);当把细胞裂解时间调整为4h、OD值为1.8、SpeI24U酶切20h、电泳条件调整为脉冲时间为2.16~54.17s、脉冲角度为120°、电场强度为6V/cm、电泳22h时,图像较前面条件清晰,但图像相对靠下(图1D);当OD值为1.8、细胞裂解4h、酶切条件调整为SpeI20U酶切20h、电泳脉冲时间调整为2.2~54.2s、脉冲角度为120°、电场强度为6V/cm、电泳25h时,酶切条带清晰可见,图像位于正中(图1E)。比较五种条件下的图像,以E条件的图像最清晰,分辨率最高,在没有图像分析仪的情况下,肉眼即可进行判断。证实所建方法可行,条件适合。LH基因组DNA片段得到良好分离,各菌株DNA条带为12~18条(图1)。3pfge电泳条件的选择由于不同的细菌,PFGE的条件存在差别。不适合的条件,会导致指纹图谱不清晰,甚至得不到指纹图谱。因此,有必要对该菌的PFGE技术的实验条件进行探讨,包括对细胞悬液的浓度、细胞裂解的条件、限制性内切酶的选择、酶切时间、电泳条件等进行反复试验研究,并对实验方法进行重复性试验。本实验结果显示,细胞悬液的浓度很重要,如果胶块中所含菌量太大则蛋白不易去除干净,背景比较深;但如果含菌量不足,酶切后则看不到条带。许多文献报道大多文献报道在细胞裂解过程中,温度一定要控制在54℃。据有关文献报道以前文献还强调胶块的厚度为1mm,以保证足够的细菌量进行酶切。现在都用配套的模具来制备胶块,模具的厚度就是1mm,这个问题不再成为关键点。而限制性内切酶的选择和水浴酶切时间成为重要环节。本实验中,选取LH具有寡切点的SpeⅠ作为限制性内切酶。有关文献报道电泳条件也是影响PFGE成败的关键。不同细菌有其各自的电泳脉冲时间。实验开始时,参照沙门氏菌PFGE的电泳条件,即脉冲时间为2.16~54.17s,脉冲角度为120°,电场强度为6V/cm,电泳22h,实验发现,此条件对于LH来说,分辨率不够高。通过反复试验,同时参考香港的报道PFGE技术的优点及其应用:目前,LH由于缺乏血清分型,主要采取生化分型,虽操作简单,但不能将所有LH进行有效分型。而PFGE的分辨系数高,