蛋白质主题知识讲座

蛋白质主题知识讲座蛋白质主题知识讲座第1页一、什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)经过肽键(peptidebond)相连形成高分子含氮化合物。蛋白质主题知识讲座第2页二、蛋白质生物学主要性1.蛋白质是生物体主要组成成份分布广：全部器官、组织都含有蛋白质；细胞各个个别都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富有机分子，占人体干重45％，一些组织含量更高，比如脾、肺及横纹肌等高达80％。蛋白质主题知识讲座第3页1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调整作用3）免疫保护作用4）物质转运和存放5）运动与支持作用6）参加细胞间信息传递2.蛋白质含有主要生物学功效3.氧化供能蛋白质主题知识讲座第4页蛋白质分子组成

TheMolecularComponentofProtein第一节蛋白质主题知识讲座第5页

组成蛋白质元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白质含有少许磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘

。蛋白质主题知识讲座第6页

各种蛋白质含氮量很靠近，平均为16％。因为体内含氮物质以蛋白质为主，所以，只要测定生物样品中含氮量，就能够依据以下公式推算出蛋白质大致含量：100克样品中蛋白质含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%

蛋白质元素组成特点蛋白质主题知识讲座第7页一、氨基酸

——组成蛋白质基础单位存在自然界中氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外）。蛋白质主题知识讲座第8页H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸通式R蛋白质主题知识讲座第9页非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸（一）氨基酸分类*20种氨基酸英文名称、缩写符号及分类以下:蛋白质主题知识讲座第10页甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00缬氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98

异亮氨酸

isoleucineIleI

6.02

苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非极性疏水性氨基酸目录蛋白质主题知识讲座第11页色氨酸

tryptophanTryW

5.89丝氨酸

serineSerS

5.68酪氨酸

tyrosineTryY

5.66

半胱氨酸

cysteineCysC

5.07

蛋氨酸

methionine

MetM

5.74天冬酰胺

asparagineAsnN

5.41

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

5.65

苏氨酸

threonineThrT5.602.极性中性氨基酸目录蛋白质主题知识讲座第12页天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22赖氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76组氨酸

histidineHisH

7.593.酸性氨基酸4.碱性氨基酸目录蛋白质主题知识讲座第13页几个特殊氨基酸

脯氨酸（亚氨基酸）蛋白质主题知识讲座第14页

半胱氨酸+胱氨酸二硫键-HH蛋白质主题知识讲座第15页（二）氨基酸理化性质1.两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液酸碱度。等电点(isoelectricpoint,pI)

在某一pH溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液pH值称为该氨基酸等电点。蛋白质主题知识讲座第16页pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸兼性离子阳离子阴离子蛋白质主题知识讲座第17页2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸最大吸收峰在280nm

附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm光吸收值是分析溶液中蛋白质含量快速简便方法。芳香族氨基酸紫外吸收蛋白质主题知识讲座第18页3.茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。因为此吸收峰值与氨基酸含量存在正比关系，所以可作为氨基酸定量分析方法。蛋白质主题知识讲座第19页二、肽*肽键(peptidebond)是由一个氨基酸

-羧基与另一个氨基酸

-氨基脱水缩合而形成化学键。（一）肽(peptide)蛋白质主题知识讲座第20页+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键蛋白质主题知识讲座第21页*肽是由氨基酸经过肽键缩合而形成化合物。*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……*

肽链中氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。*由十个以内氨基酸相连而成肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多氨基酸相连形成肽称多肽(polypeptide)。蛋白质主题知识讲座第22页N末端：多肽链中有自由氨基一端C末端：多肽链中有自由羧基一端多肽链有两端*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成一个结构。蛋白质主题知识讲座第23页N末端C末端牛核糖核酸酶蛋白质主题知识讲座第24页（二）几个生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)蛋白质主题知识讲座第25页GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+蛋白质主题知识讲座第26页

体内许多激素属寡肽或多肽

神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽蛋白质主题知识讲座第27页三、蛋白质分类*依据蛋白质组成成份单纯蛋白质结合蛋白质=蛋白质个别+非蛋白质个别*依据蛋白质形状纤维状蛋白质球状蛋白质蛋白质主题知识讲座第28页蛋白质分子结构

TheMolecularStructureofProtein

第二节蛋白质主题知识讲座第29页蛋白质分子结构包含

一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构蛋白质主题知识讲座第30页定义蛋白质一级结构指多肽链中氨基酸排列次序。一、蛋白质一级结构主要化学键肽键，有些蛋白质还包含二硫键。蛋白质主题知识讲座第31页一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功效基础。目录蛋白质主题知识讲座第32页二、蛋白质二级结构蛋白质分子中某一段肽链局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子相对空间位置，并不包括氨基酸残基侧链构象

。定义

主要化学键：

氢键

蛋白质主题知识讲座第33页（一）肽单元参加肽键6个原子C

1、C、O、N、H、C

2位于同一平面，C

1和C

2在平面上所处位置为反式(trans)构型，此同一平面上6个原子组成了所谓肽单元

(peptideunit)

。蛋白质主题知识讲座第34页

蛋白质二级结构主要形式

-螺旋(

-helix)

-折叠(

-pleatedsheet)

-转角(

-turn)

无规卷曲(randomcoil)

蛋白质主题知识讲座第35页（二）

-螺旋目录蛋白质主题知识讲座第36页（三）

-折叠蛋白质主题知识讲座第37页（四）

-转角和无规卷曲

-转角无规卷曲是用来阐述没有确定规律性那个别肽链结构。蛋白质主题知识讲座第38页（五）模体在许多蛋白质分子中，可发觉二个或三个含有二级结构肽段，在空间上相互靠近，形成一个特殊空间构象，被称为模体(motif)。蛋白质主题知识讲座第39页钙结合蛋白中结合钙离子模体

锌指结构蛋白质主题知识讲座第40页（六）氨基酸残基侧链对二级结构形成影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础。一段肽链其氨基酸残基侧链适合形成

-螺旋或β-折叠，它就会出现对应二级结构。蛋白质主题知识讲座第41页三、蛋白质三级结构疏水键、离子键、氢键和VanderWaals力等。主要化学键整条肽链中全部氨基酸残基相对空间位置。即肽链中全部原子在三维空间排布位置。（一）定义蛋白质主题知识讲座第42页目录蛋白质主题知识讲座第43页

肌红蛋白(Mb)N端C端蛋白质主题知识讲座第44页纤连蛋白分子结构域（二）结构域大分子蛋白质三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状区域，折叠得较为紧密，各行使其功效，称为结构域(domain)。蛋白质主题知识讲座第45页（三）分子伴侣分子伴侣(chaperon)经过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠整天然构象或形成四级结构。*分子伴侣可逆地与未折叠肽段疏水个别结合随即松开，如此重复进行可预防错误聚集发生，使肽链正确折叠。*分子伴侣也可与错误聚集肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。*分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键正确形成起了主要作用。蛋白质主题知识讲座第46页亚基之间结协力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。四、蛋白质四级结构蛋白质分子中各亚基空间排布及亚基接触部位布局和相互作用，称为蛋白质四级结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整三级结构，称为蛋白质亚基(subunit)。蛋白质主题知识讲座第47页血红蛋白四级结构

蛋白质主题知识讲座第48页蛋白质结构与功效关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三节蛋白质主题知识讲座第49页（一）一级结构是空间构象基础一、蛋白质一级结构与功效关系牛核糖核酸酶一级结构二硫键蛋白质主题知识讲座第50页

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性蛋白质主题知识讲座第51页（二）一级结构与功效关系例：镰刀形红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)

这种由蛋白质分子发生变异所造成疾病，称为“分子病”。蛋白质主题知识讲座第52页（一）肌红蛋白与血红蛋白结构二、蛋白质空间结构与功效关系目录蛋白质主题知识讲座第53页Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb百分数（称百分饱和度）随O2浓度改变而改变。（二）血红蛋白构象改变与结合氧蛋白质主题知识讲座第54页肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)氧解离曲线蛋白质主题知识讲座第55页*协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力现象，称为协同效应。假如是促进作用则称为正协同效应(positivecooperativity)假如是抑制作用则称为负协同效应

(negativecooperativity)蛋白质主题知识讲座第56页蛋白质主题知识讲座第57页O2血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环小孔中，继而引发肽链位置变动。蛋白质主题知识讲座第58页变构效应(allostericeffect)蛋白质空间结构改变伴随其功效改变，称为变构效应。蛋白质主题知识讲座第59页（三）蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质构象发生改变，仍可影响其功效，严重时可造成疾病发生。蛋白质主题知识讲座第60页蛋白质构象改变造成疾病机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀病理改变。这类疾病包含：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。蛋白质主题知识讲座第61页疯牛病中蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引发一组人和动物神经退行性病变。正常PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质作用下可转变成全为β-折叠PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病蛋白质主题知识讲座第62页第四节蛋白质理化性质与分离纯化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein蛋白质主题知识讲座第63页（一）蛋白质两性电离一、理化性质蛋白质分子除两端氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中一些基团，在一定溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷基团。*蛋白质等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液pH称为蛋白质等电点。蛋白质主题知识讲座第64页（二）蛋白质胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定原因颗粒表面电荷水化膜蛋白质主题知识讲座第65页+++++++带正电荷蛋白质－－－－－－－－带负电荷蛋白质在等电点蛋白质水化膜++++++++带正电荷蛋白质－－－－－－－－带负电荷蛋白质不稳定蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质聚沉蛋白质主题知识讲座第66页（三）蛋白质变性、沉淀和凝固*蛋白质变性(denaturation)在一些物理和化学原因作用下，其特定空间构象被破坏，也即有序空间结构变成无序空间结构，从而造成其理化性质改变和生物活性丧失。蛋白质主题知识讲座第67页

造成变性原因如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。

变性本质——

破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质一级结构。蛋白质主题知识讲座第68页

应用举例临床医学上，变性原因常被应用来消毒及灭菌。另外,预防蛋白质变性也是有效保留蛋白质制剂（如疫苗等）必要条件。

蛋白质主题知识讲座第69页若蛋白质变性程度较轻，去除变性原因后，蛋白质仍可恢复或个别恢复其原有构象和功效，称为复性(renaturation)。蛋白质主题知识讲座第70页

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性蛋白质主题知识讲座第71页*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后絮状物加热可变成比较坚固凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

蛋白质主题知识讲座第72页（四）蛋白质紫外吸收因为蛋白质分子中含有共轭双键酪氨酸和色氨酸，所以在280nm波优点有特征性吸收峰。蛋白质OD280与其浓度呈正比关系，所以可作蛋白质定量测定。蛋白质主题知识讲座第73页（五）蛋白质呈色反应⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)

蛋白质经水解后产生氨基酸也可发生茚三酮反应。⒉双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，展现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。蛋白质主题知识讲座第74页二、蛋白质分离和纯化（一）透析及超滤法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开方法。*超滤法

应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量超滤膜，到达浓缩蛋白质溶液目标。蛋白质主题知识讲座第75页（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀*使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量普通10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应马上分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，造成蛋白质沉淀。蛋白质主题知识讲座第76页*

免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可取得抗该蛋白特异抗体。利用特异抗体识别对应抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物性质，可从蛋白质混合溶液中分离取得抗原蛋白。蛋白质主题知识讲座第77页（三）电泳蛋白质在高于或低于其pI溶液中为带电颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种经过蛋白质在电场中泳动而到达分离各种蛋白质技术,称为电泳(elctrophoresis)

。依据支撑物不一样，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。

蛋白质主题知识讲座第78页几个主要蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常见于蛋白质分子量测定。*等电聚焦电泳，经过蛋白质等电点差异而分离蛋白质电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究主要技术。蛋白质主题知识讲座第79页（四）层析层析(chromatography)分离蛋白质原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，依据溶液中待分离蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离蛋白质组分在两相中重复分配，并以不一样速度流经固定相而到达分离蛋白质目标。蛋白质主题知识讲座第80页蛋白质分离常见层析方法*离子交换层析：利用各蛋白质电荷量及性质不一样进行分离。*凝胶过滤(g