克氏原螯虾源对虾白斑综合征病毒的初步鉴定

克氏原螯虾源对虾白斑综合征病毒的初步鉴定

近年来，克氏家族的原虾(。白斑综合征病毒(WSSV)为一种无包涵体病毒,地理分布广,流行范围大,传染性强,对发病虾致死时间短,目前尚无有效的治疗药物,还不能有效地控制疫情11.1病例对照加冰保存患病克氏原螯虾样品采自江苏省扬州邵伯湖、淮安白马湖、盱眙、南京禄口等地的养殖场(分别记为A、B、C、D),各取典型患病样品20～50只,平均体重30g,所有样品均用保温箱加冰保存。在取样过程中,测量和记录养殖池水的常规水质指标,了解克氏原螯虾的养殖过程、养殖管理,观察和总结发病特征及流行情况(表1)。1.2提取溶剂、冲洗液、内纤维膜分别取患病克氏原螯虾鳃少许,切成0.5mm×0.5mm×0.5mm大小的组织块,置于4%戊二醛溶液中固定;固定后的样品经PBS冲洗3次,1%锇酸固定2h;PBS冲洗3次,丙酮系列脱水;Epon′s812树脂包埋,37℃过夜,60℃12h以上。超薄切片厚度为50～100nm,切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色之后在H-600型透射电子显微镜观察并拍照。1.3wssv在克氏原螯虾体内的感染特性在组织病理切片中观察到类似WSSV病毒颗粒后,设计出WSSV特异性引物,进行PCR验证。为了解病毒在克氏原螯虾体内不同组织间的侵染特性,笔者还分别对患病虾的鳃、心肌、肠道、神经、肌肉等组织进行了WSSV的检测。此外还检测了另两种常见对虾病毒:桃拉病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV),检测方法参照文献1.3.1st引物的设计根据GenBank中WSSV序列(AF369029),利用Dnastar引物设计软件设计1对特异性引物,引物序列为:C4:5′-TCACAGGCGTATTGTCTCTCCT-3′;N4:5′-CACGAGTCTACCGTCACAACATC-3′,扩增产物为300bp。1.3.2消化液ld50在冰上分别取病虾肌肉、神经、鳃、肝脏等组织少许于离心管中,加1.2mL消化液(100mmol·L1.3.3PCR总反应体积设为25μL,其中含去离子水14.85μL,STR10×Buffer(Mg1.41.4.1感染实验结果人工感染用的健康克氏原螯虾采自江苏省某无公害养殖基地,平均体重30g,采回后置于水族箱(1096cm×470cm×670cm)中暂养7d,发现无异常后开始感染实验。1.4.2加吾ppb缓冲液分离病虾的肝胰腺、鳃、肌肉、心脏等,加少许PPB缓冲液(376mmol·L1.4.3样品的制备暂养后的克氏原螯虾随机分为3组,每组20只,其中第1、2组分别于第1、2腹节肌肉注射0.1mL的病毒液,第3组为对照组,注射等体积的PPB缓冲液作为对照。实验期间水温保持在27～29℃,每天换水50%,充气培养。人工感染后,记录克氏原螯虾的体表变化,运动、摄食及死亡情况,连续观察10d。1.5wssv检测利用建立的特异性引物PCR方法,对采集自邵伯湖、白马湖、盱眙、禄口等地100余只克氏原螯虾样品进行WSSV检测。22.1螯下肢无定形初期无明显症状,后期不摄食,反应迟钝,应激能力较弱;螯肢及附肢无力,无法支撑身体;血淋巴不易凝固,头胸甲易剥离,肝胰腺颜色淡黄,腹节肌肉苍白;在头胸甲部位常出现白斑。死亡率约为30%～50%。2.2肝胰腺组织病理学观察在对患病克氏原螯虾进行透射电子显微镜观察时发现其鳃上皮细胞有较明显病变,细胞核肥大,病毒颗粒充胀着细胞核(图1)。2.32.3.1wssv和ihhnv感染的比较对邵伯湖、白马湖、盱眙、禄口等地患病克氏原螯虾的WSSV检测结果均呈明显的阳性,电泳条带明亮,感染程度较高;而TSV和IHHNV检测均呈阴性;健康克氏原螯虾则没有条带出现(图2)。2.3.2wssv感染检测结果显示,患病克氏原螯虾的鳃、肝脏、心肌、神经、前肠、中肠、后肠、肌肉等组织同时受到了WSSV感染,提示在患病后期病毒颗粒已扩散至虾体全身(图3)。2.4克氏原螯虾感染后死亡情况感染克氏原螯虾于第2天开始出现反应迟钝,静卧不动,螯肢及附肢无力,肝胰腺颜色淡黄等症状,在第3～9天出现死亡现象,感染后3～6天为死亡高峰期,症状与自然发病克氏原螯虾相同,实验组死亡率分别为95%和100%;对照组全部存活,无异常症状。在人工感染发病的克氏原螯虾病理切片中再次观察到WSSV病毒颗粒,PCR检测呈阳性,证实WSSV即为导致此次养殖克氏原螯虾暴发死亡的病源。2.5tsv和ihhnv感染情况从邵伯湖、白马湖、盱眙、禄口等地采集了3批次共计140余只样品,WSSV检出率30%～52%,所有样品中没有发现TSV和IHHNV感染(表2)。3人工感染实验对虾白斑综合征病毒是一种严重危害当前对虾养殖业的对虾病毒,主要引起对虾甲壳内侧白斑病变,并导致大批死亡目前克氏原螯虾等甲壳动物病毒病的诊断手段主要包括病理学方法、生物学方法、免疫学方法、分子杂交方法及PCR方法等此外,在进行人工感染实验时发现,制备的WSSV病毒液置于4℃冰箱中过夜后依然有致病性,而置于常温(29～31℃)下,5～6h即丧失活性。这表明在自然环境中WSSV抗逆能力并不强,当环境温度稍高时,病毒粒子即易失去感染活性,提示WSSV在克氏原螯虾养殖塘或自然水域中可能不以离体传播为主要方式,病毒更可能以存在于组织内的形式,通过生物间的