中药生产中的十八亚慢性毒性试验研究

中药生产中的十八亚慢性毒性试验研究

党参，名：codolosula（franch.）nanf。桔梗科党参属,多年生草本植物,有乳汁;茎基具多数瘤状茎痕,根常肥大呈纺锤状或纺锤状圆柱形,较少分枝或中部以下略有分枝,表面灰黄色,上端5cm~10cm部分有细密环纹;生于海拔1560m~3100m的山地林边及灌丛中,中国各地有大量栽培党参为常用大宗药材,其性味甘平、无毒,有补中益气、生津止渴等功效。现代药理学研究证实,党参对心血管系统、血液及造血功能、消化系统、机体免疫功能、延缓衰老、抗疲劳、抑制癌细胞等均可起到相应的药理作用1材料和方法1.1材料表面1.1.1种子提取党参由山西振东制药股份有限公司提供,党参原料呈长圆柱形,表面灰黄色、黄棕色至灰棕色。实验前取党参原料按照料液比为1∶8的比例,加水浸泡30min,在微沸状态下提取2次,合并提取液,过滤;滤过的残渣用75%的乙醇,按照料液比为1∶10的比例,回流提取2次,合并提取液,过滤。将水提和醇提的滤液合并,在70℃~75℃、-0.07Mpa~-0.08Mpa的条件下进行浓缩,对浓缩液进行微波干燥、粉碎后,制成提取物粉待用,1g提取物粉相当于2g原料。1.1.2实验动物与体质量试验用ICR小鼠由浙江省实验动物中心提供,实验动物生产许可证号为SCXK(浙)2014-0001,实验动物使用许可证号为SYXK(浙)2014-0008。体质量为18g~22g,雌雄各半,用于急性经口毒性试验;体质量为25g~30g,雌雄各半,用于遗传毒性试验。饲养温度为20℃~25℃,饲养湿度为40%~70%1.1.3蘑菇细菌回复突变试验选用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌,共4株,即TA1.2深圳蓝韵服务业有限公司TEK8530全自动五分类血液分析仪(江西特康科技有限公司);XL1800血凝仪(上海迅达医学科技有限公司);蓝韵LWC400全自动生化分析仪(深圳蓝韵实业有限公司);XD685电解质分析仪(杭州众驰科技有限公司);尿液分析仪(桂林优利特医疗电子有限公司);YZ11D检眼镜(苏州六六视觉科技股份有限公司)。2-乙酰氨基芴(批号:STBF2-332V);1,8-二羟基蒽醌(批号:WXBC4791V);叠氮钠(批号:81G10150);敌克松(批号:285-75B);丝裂霉素C(批号:M0308A);环磷酰胺(批号:MKBS0-021V);秋水仙素(批号:J1210A)。1.3方法1.3.1急性口腔毒性试验1.3.1.灌胃二次新鲜度20%选用健康、成熟ICR小鼠20只,雌雄各半,按限量法设提取物20.0g/kgBW一个剂量组。称取提取物20g,以1%羧甲基纤维素钠为溶媒配制成40ml样品液。小鼠灌胃前禁食(不禁水)6h,按20ml/kgBW灌胃容量灌胃二次,间隔4h。末次灌胃2h后动物自由进食、饮水。1.3.1.灌胃前后大鼠不良反应比较选用健康、成熟SD大鼠20只,雌雄各半,按限量法设提取物20.0g/kgBW一个剂量组。称取提取物300g,以1%羧甲基纤维素钠为溶媒配制成450ml样品液。大鼠灌胃前禁食(不禁水)6h,按10ml/kgBW灌胃容量灌胃3次,间隔4h。末次灌胃3h后动物自由进食、饮水。1.3.2细菌回复突变试验试验采用平板掺入法,选择试验浓度为8μg/皿、40μg/皿、200μg/皿、1000μg/皿、5000μg/皿5个剂量组。1.3.3小鼠提取物制备试验小鼠随机分为5组,每组10只,雌雄各半,分别设为阴性对照组(1%羧甲基纤维素钠)、阳性对照组(环磷酰胺)、2.5g/kg、5.0g/kg、10.0g/kg剂量组。按20ml/kgBW灌胃量经口灌胃给予小鼠提取物,灌胃2次,间隔24h。第2次灌胃后6h处死动物,取胸骨骨髓制片,干燥固定,Giemsa染色。1.3.4秋水仙素酯类化合物环磷酰胺盐酰胺2次注射小鼠随机分为5组,每组5只。设2.5g/kg、5.0g/kg、10.0g/kg3个剂量组。另设一个阴性对照组(1%羧甲基纤维素钠)和一个阳性对照组(环磷酰胺40mg/kgBW,称取环磷酰胺80mg,加生理盐水溶解至40ml,单次腹腔注射)。各剂量组小鼠按20ml/kgBW灌胃容量经口灌胃给予提取物,连续5d,1d1次。各组均于第一次给予提取物后的第13d将小鼠处死采样。小鼠处死前5h腹腔注射秋水仙素6mg/kgBW。用颈椎脱臼法处死小鼠,取2侧睾丸,低渗处理,分离曲细精管,吹打静置,以固定液固定2次,常规离心,去上清液后于低温环境下滴片,自然干燥,Giemsa染色。1.3.5动物剖检指标试验用SD大鼠适应性喂养后,按体质量随机分组,每组20只,雌雄各半,设1个阴性对照组(基础饲料)和3个提取物剂量组:2.0g/kgBW、4.0g/kgBW、8.0g/kgBW(相当于党参4.0g/kgBW、8.0g/kgBW、16.0g/kgBW);在阴性对照组和高剂量组添加卫星组。将提取物按体质量8%折算掺入饲料中喂养,大鼠自由进食、饮水,连续观察13周,每周记录体质量和进食量并计算食物利用率,试验中期对卫星组大鼠进行尿常规检测,禁食过夜,腹主动脉采血测定血常规及血生化指标;试验末期所有大鼠进行尿常规检测,禁食过夜,腹主动脉采血测定血生化及血常规指标,解剖动物观察各脏器大体改变,摘取脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、睾丸/卵巢、附睾/子宫、肾上腺、胸腺测定湿重,计算脏体比;取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、垂体、甲状腺、胸腺、胃、十二指肠、胰脏、空肠、回肠、结肠、直肠、膀胱、淋巴结、肾上腺、前列腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫进行病理组织学观察,脏器石蜡切片,苏木素-伊红(HE)染色。1.4统计处理采用SPSS16.0软件进行数据分析,计量资料采用配对t检验,计数资料采用χ2结果2.1急性口腔毒性试验以20g/kgBW剂量的提取物对大小鼠进行试验后未见明显中毒症状。党参提取物对雌雄大小鼠的经口LD2.2回复突变试验对TA97、TA98、TA100、TA1024株试验菌株,不同浓度提取物在加和不加S9条件下的回变菌落数与阴性对照组近似,而阳性对照组回变菌落数均高于阴性对照组回变菌落数2倍以上。党参提取物细菌回复突变试验检测结果为阴性,重复试验仍得出相同结果。2.3各组大鼠血清中血清型马来安氏氏菌性别的比较党参提取物哺乳动物红细胞微核试验阳性对照组微核发生率(雄性2.12%,雌性2.08%)明显高于阴性对照组(雄性0.22%,雌性0.22%),差异有统计学意义(P<0.01),而各剂量组(雄性0.27%~0.30%,雌性0.27%~0.29%)与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组PCE/RBC比值均在正常范围内,表明党参提取物对哺乳动物红细胞微核未见明显影响,检测结果为阴性。2.4不同统计学意义的比较党参提取物各剂量组染色体异常细胞率(0.4%~0.6%)与阴性对照组(0.8%)比较差异无统计学意义(P>0.05);而阳性对照组染色体异常细胞率(9.2%)明显高于阴性对照组染色体异常细胞率(0.8%),差异有统计学意义(P<0.01)。表明党参提取物对小鼠精母细胞染色体畸变发生率未见明显影响,检测结果为阴性。2.590d口腔毒性试验2.5.1一般观察2.5.2党参对大鼠体重增加、总食入量和总食物利用率的影响在整个试验期,提取物各剂量组雌、雄大鼠的增重及食物利用率与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。2.5.3正常范围及血常规及血生化指标雄性高剂量组大鼠ALT指标明显低于阴性对照组(P<0.05),其余各剂量组的雌雄大鼠在试验中所测得的血常规指标及血生化指标均在正常范围(表2、表3)。2.5.4对大鼠脏器组织病理学改变的影响各剂量组雌性和雄性试验大鼠的脏器重量与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。病理切片显微镜检发现:阴性对照组2只雄鼠可见轻度胰腺腺泡间脂肪细胞浸润;高剂量组均有1只雄鼠可见汇管区轻度淋巴细胞浸润;阴性对照组3只雄鼠、3只雌鼠,高剂量组4只雄鼠、3只雌鼠可见轻度肺泡间隔变宽;阴性对照组1只雄鼠可见轻度间质性肺炎;高剂量组1只雄鼠、1只雌鼠可见轻度肺泡脂质沉积;阴性对照组8只雄鼠、10只雌鼠,高剂量组8只雄鼠、7只雌鼠可见轻度肾小管扩张;阴性对照组2只雄鼠可见轻度肾间质淋巴细胞浸润;阴性对照组1只雄鼠可见轻度肾小管再生;阴性对照组1只雄鼠可见轻度附睾炎;阴性对照组3只雄鼠,高剂量组2只雄鼠可见轻度前列腺炎。高剂量组雌、雄大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、垂体、甲状腺、胸腺、胃、十二指肠、胰脏、空肠、回肠、结肠、直肠、膀胱、淋巴结、肾上腺、前列腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫均未见明显与试验因素有关的病理组织学变化。党参提取物对试验大鼠大体解剖、组织学观察未见明显影响。3对野生参保动物的安全性评价党参在我国的种植历史悠久,是常用的传统补益药,古代以山西上党地区出产的党参为上品,目前市场上的党参主产于山西、甘肃、陕西、四川、湖北等省,主要为栽培品,少量为野生党参中包含甾醇类、多糖、生物碱、挥发油、三萜