生物制药酶工程制药专家讲座

第四章酶工程制药生物制药酶工程制药专家讲座第1页国际酶工程学会（1971年）定义：

酶工程是研究和开发酶生产、酶分离纯化、酶固定化、酶及固定化酶反应器、酶与固定化酶应用等工程科学。

生物制药酶工程制药专家讲座第2页酶工程制药主要包含药用酶生产和酶法制药两方面技术。药用酶是指可用于预防和治疗疾病酶。酶法制药是指利用酶催化作用而制造出含有药用功效物质技术过程.药用酶：酶法制药：生物制药酶工程制药专家讲座第3页第一节概述酶是生物催化剂。是由活细胞产生以蛋白质为主要成份生物催化剂，它能催化各种生物化学反应。生物制药酶工程制药专家讲座第4页一、酶催化特征催化剂共同点量少高效；只加速可逆反应进程，而不改变反应平衡点。都是经过降低反应分子活化能来加紧化学反应速度。酶特征高效催化高度专一条件温和生物制药酶工程制药专家讲座第5页1、酶专一性强酶专一性（specificity)：是指一个酶只能催化一个或一类结构相同底物进行某种类型反应。生物制药酶工程制药专家讲座第6页绝对专一性(absolutespecificity)：只能作用于特定结构底物，进行一个专一反应，生成一个特定结构产物。立体结构特异性(stereo

specificity)：作用于立体异构体中一个。相对专一性(relativespecificity)：作用于一类化合物或一个化学键。依据酶对其底物结构选择严格程度不一样，酶专一性可大致分为以下2种类型：生物制药酶工程制药专家讲座第7页2、酶催化效率高

酶催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比普通催化剂高107～1013倍。酶和普通催化剂加速反应机理都是降低反应活化能(activationenergy)。酶比普通催化剂更有效地降低反应活化能。生物制药酶工程制药专家讲座第8页3、酶作用条件温和酶催化不需要较高反应温度。酶催化作用普通都在常温、常压、pH近乎中性温和条件下进行，不需高温高压和极端pH条件。生物制药酶工程制药专家讲座第9页二、影响酶催化作用主要原因1、酶浓度对酶促反应影响在有足够底物和其它条件不变情况下：

v=k[E]酶促反应速度与酶浓度成正比生物制药酶工程制药专家讲座第10页2、底物浓度对酶促反应影响[S]vVmax一级反应

v=k[S]零级反应

v=k[E]混合级反应生物制药酶工程制药专家讲座第11页当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax生物制药酶工程制药专家讲座第12页伴随底物浓度增高反应速度不再成正百分比加速；反应为混合级反应。[S]VVmax生物制药酶工程制药专家讲座第13页当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应[S]VVmax生物制药酶工程制药专家讲座第14页3、pH对酶促反应影响1.最适pH2.有效pH表现出酶最大活力pH值在一定pH范围内酶是稳定pH对酶作用影响机制：

1.环境过酸、过碱使酶变性失活；

2.影响酶活性基团解离；

3.影响底物解离。0酶活性pH

pH对一些酶活性影响

胃蛋白酶淀粉酶胆碱酯酶246810生物制药酶工程制药专家讲座第15页双重影响温度升高，酶促反应速度升高；因为酶本质是蛋白质，温度升高，可引发酶变性，从而反应速度降低。

4、温度对酶促反应影响最适温度(optimumtemperature)：酶促反应速度最快时环境温度。其不是酶特征性常数酶活性0.51.02.01.50102030405060温度ºC温度对淀粉酶活性影响

生物制药酶工程制药专家讲座第16页5、激活剂对酶促反应影响激活剂使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加物质。其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等；无机离子对酶激活作用：（1）与酶分子肽链上侧链基团相结合，稳定酶催化作用所需构象。（2）作为底物与酶蛋白之间联络桥梁。（3）可能作为辅酶或辅基一个组成部分，帮助酶催化作用。生物制药酶工程制药专家讲座第17页使用激活剂注意激活剂对酶作用含有一定选择性，使用不妥，会适得其反，激活剂之间有时存在拮抗现象。激活剂浓度有一定范围，超出此范围，会得到相反效果。生物制药酶工程制药专家讲座第18页6、抑制剂对酶促反应影响——使酶必需基团或活性部位中基团化学性质改变而降低酶活力甚至使酶失活物质，称为抑制剂（I）。（1）.不可逆抑制作用：抑制剂与酶结合（共价键）是不可逆。S+EESE+P

+I↓EIE—SH+ICH2COOH→E—S—CH2COOH+HI抑制作用特点：不可逆性抑制，抑制剂浓度越高，抑制作用时间越长，抑制作用越强。生物制药酶工程制药专家讲座第19页（2）可逆抑制作用：抑制剂与酶结合是可逆。抑制程度是由酶与抑制剂之间亲和力大小、抑制剂浓度以及底物浓度决定。[E]v1231.反应体系中不加I。2.反应体系中加入一定量不可逆抑制剂。3.反应体系中加入一定量可逆抑制剂。生物制药酶工程制药专家讲座第20页[E]v不可逆抑制剂作用[E]v可逆抑制剂作用[I]→[I]生物制药酶工程制药专家讲座第21页①竞争性抑制作用：抑制剂和底物竞争与酶结合。特点：1）抑制剂和底物竞争酶结合部位。2）抑制程度取决于I和S浓度以及与酶结合亲和力大小。3）竞争性抑制剂结构与底物结构十分相同。S+EESE+P

+I↑↓EI生物制药酶工程制药专家讲座第22页②非竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时与酶结合，但形成EIS不能深入转变为产物。S+EESE+P

+I↑↓EI

+I↑EIS+[S]E+P特点：1）伴随抑制剂浓度[I]增加，抑制作用增强。2）底物浓度增减对抑制作用不产生影响。3）抑制剂不改变酶对底物亲和力。生物制药酶工程制药专家讲座第23页③反竞争性抑制作用：I与酶和底物中间复合物结合而不与游离酶结合，从而抑制酶活性。S+EESE+P

+I↑EISE+P特点：1）伴随抑制剂浓度[I]增加，抑制作用增强。2）底物浓度增减对抑制作用不产生影响。3）抑制不改变酶对底物亲和力。生物制药酶工程制药专家讲座第24页三、酶分类与命名（一）、酶命名1、习惯名：命名标准以下－－（1.）依据酶底物命名。（2.）依据所催化反应性质命名。（3.）有酶结合上述两个标准命名。（4.）在这些基础上有时还加上酶起源或酶其它特点。生物制药酶工程制药专家讲座第25页2、系统名：要求能确切表明底物化学本质及酶性质，包含两部分，即底物名称及反应类型，底物间用“：”分开，若底物之一是水则可略去不写。ATP+CH3COOHADP+CH3CO~P其系统名为：ATP：乙酸磷酸转移酶生物制药酶工程制药专家讲座第26页（二）、酶分类依据反应性质分为六大类1、氧化还原酶类：催化氧化还原反应，包括H和电子转移。如脱氢酶类。2、转移酶类：催化分子间功效基团转移。如转氨酶类。生物制药酶工程制药专家讲座第27页3．水解酶类：催化水解反应。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶等。4．裂合酶类：催化非水解地除去底物分子中基团及其逆反应酶。如醛缩酶脱氨酶脱羧酶生物制药酶工程制药专家讲座第28页5．异构酶类：催化同分异构体相互转变。6、合成酶：与ATP分解相偶联，并由二种物质合成一个物质。如天冬酰胺合成酶丙酮酸羧化酶生物制药酶工程制药专家讲座第29页在每一大类酶中，又依据底物中被作用基团或键特点分为若干亚类，然后再把属于某一亚类、亚亚类酶按次序排好，这么把已知酶分门别类地排成一个表，叫做酶表。类亚类亚亚类序号生物制药酶工程制药专家讲座第30页如EC1.1.1.27为乳酸：NAD+氧化还原酶

EC1.1.1.37为苹果酸：NAD+氧化还原酶

EC1.1.1.1为乙醇：NAD+氧化还原酶生物制药酶工程制药专家讲座第31页一些酶命名举例生物制药酶工程制药专家讲座第32页四、酶活力及其测定酶定量并非对其蛋白质进行定量，而是对它催化能力进行定量。所以，酶定量就是测定酶活力，也即测定酶促反应速度。生物制药酶工程制药专家讲座第33页1.酶活力及测定酶活力

是酶促反应能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化某一化学反应速度快慢，即酶催化反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。

生物制药酶工程制药专家讲座第34页酶活力测定酶活力测定包含两个阶段。首先要在一定条件下，将酶与其作用底物混合均匀，反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物改变量。步骤：（1）依据酶专一性，选择适宜底物，并配置成一定浓度底物溶液。（2）依据资料或试验结果，确定酶催化反应温度、pH值等条件。（3）在一定条件下，将一定量酶液与一定量底物溶液混合均匀，统计开始时间。（4）反应到一定时间，取出适量反应液利用各种适合生化检测技术，测定产物生成量或底物降低许。生物制药酶工程制药专家讲座第35页①反应时间一到，马上取出一定量反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活。②马上加入适宜酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活。③马上加入酸或碱溶液，使反应液pH值快速远离酶促反应最适pH值，从而终止反应。④将取出反应液马上置于冰粒堆或冰盐溶液中，使反应液温度快速降低到10℃以下。惯用终止酶反应方法：生物制药酶工程制药专家讲座第36页2.酶活力单位

酶活力单位(1961年)：在特定条件下，每分钟催化1微摩尔底物转化为产物酶量，定义为一个酶活力单位，用U表示。

特定条件是指：温度可采取25℃或其它选取温度，其它条件均采取最适条件。生物制药酶工程制药专家讲座第37页3.酶比活力指每毫克酶蛋白所含酶活力单位数比活力＝酶活力单位数（U）酶蛋白质量（mg）比活力是酶制剂纯度惯用指标——比活力越大，表示酶越纯。生物制药酶工程制药专家讲座第38页第二节药用酶生产

生物制药酶工程制药专家讲座第39页一、药用酶种类1、蛋白酶:蛋白酶当前可用作：(1)消化剂(2)消炎剂(3)治疗高血压生物制药酶工程制药专家讲座第40页α-淀粉酶水解淀粉生成糊精，是国际上广泛使用消化药。最早采取米曲霉生产复合α-淀粉酶，其中还含有蛋白酶、脂肪酶等各种酶。但因为米曲霉α-淀粉酶适宜pH值为4.5~6.0所以在胃中易受胃酸破坏。用黑曲霉酸性淀粉酶作为消化药，不易受胃酸破坏，效果会更加好。2、α-淀粉酶生物制药酶工程制药专家讲座第41页脂肪酶催化脂肪水解生成甘油和脂肪酸，可作为消化剂使用。

假单胞菌脂肪酶能分解血液中低密度脂白和乳糜微粒，可用于预防和治疗高血脂病。3、脂肪酶生物制药酶工程制药专家讲座第42页该酶水解右旋糖酐生成小分子产物，对龋齿有显著预防效果。龋齿是一个常见口腔疾病，其病因是因为口腔中细菌将蔗糖合成结构类似右旋糖酐粘性多糖，粘附在牙齿表面，引发细菌滋生，而使牙齿受到损坏。将右旋糖酐酶应用到牙膏，可有效防治龋齿产生。4、右旋糖酐酶生物制药酶工程制药专家讲座第43页溶菌酶含有抗菌，消炎，镇痛等疗效，是一个广泛应用药用酶。溶菌酶作用于细菌细胞壁，使其受到破坏，而使病原菌、腐败性细菌等溶解死亡。溶菌酶与抗生素联合使用，可显著提升抗生素疗效.5、溶菌酶生物制药酶工程制药专家讲座第44页SOD催化超氧负离子（O-2）进行氧化还原反应生成氧和双氧水。（2O-2+2H+→H2O2+O2）因为SOD能去除体内超氧负离子，含有抗氧化、抗辐射、抗衰老功效，保护机体内DNA、蛋白质和细胞膜等免遭超氧负离子破坏，对红斑狼疮、皮肤炎、结肠炎、白内障、风湿性关节炎、氧中毒等疾病有显著疗效，对辐射有防护作用。6、超氧化物歧化酶(SOD)生物制药酶工程制药专家讲座第45页Asn→Asp+NH3

抗癌药品癌细胞不含天冬酰胺合成酶,本身不能合成L-天冬酰胺，而外源L-Asn又被加入L-天冬酰胺酶分解掉，所以，蛋白质合成受阻，从而造成癌细胞死亡。7、L-天冬酰胺酶生物制药酶工程制药专家讲座第46页链激酶：β-溶血性链球菌产生一个蛋白酶，可催纤维蛋白酶原，激活成纤维蛋白酶而将纤维蛋白水解使血栓溶解。

尿激酶：从尿液中分离得到一个蛋白酶，含有溶解血栓疗效，其副作用比链激酶小。

纳豆激酶：由纳豆杆菌或枯草芽孢杆菌产生一个蛋白酶，含有溶解血栓功效，能够口服。

8、溶栓酶生物制药酶工程制药专家讲座第47页9、乳糖酶乳糖酶又称β-半乳糖苷酶，它催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖。乳糖酶可用于治疗乳糖酶缺乏症。生物制药酶工程制药专家讲座第48页利用各种生化分离技术，从动物、植物及微生物等含酶细胞、组织或器官中提取、分离和纯化各种药用酶方法称为提取法。二、药用酶生产方法1、提取法：生物制药酶工程制药专家讲座第49页利用各种动物、植物和微生物细胞生命活动而取得人们所需酶方法称为生物合成法。主要是利用微生物细胞进行生产。2、生物合成法：生物制药酶工程制药专家讲座第50页化学合成法是60年代中期出现新技术。

1965年，我国人工合成胰岛素成功，开辟了蛋白质化学合成新纪元。

3、化学合成法:1969年，美国首次用化学合成法得到含有124个氨基酸核糖核酸酶。化学合成法合成成本高昂，且只能合成已知化学结构酶,至今停留在试验室阶段。生物制药酶工程制药专家讲座第51页经过筛选、诱变或采取基因工程、细胞工程等技术而取得。三、药用酶生产细胞选择用于酶发酵生产细胞必须具备条件：1、酶产量高生物制药酶工程制药专家讲座第52页2、

轻易培养和管理适应性较强，易于生长繁殖，便于管理。3、

产酶稳定性好不易退化，能稳定地用于生产。4利于酶分离纯化胞外酶5、安全可靠生物制药酶工程制药专家讲座第53页惯用产酶微生物有：

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）大肠杆菌（Escherichiacoli）黑曲霉（Aspergillusniger）米曲霉（Aspergillusorizae）木霉（Trichoderma）青霉（penicillium）根霉（Rhizopus）毛霉（Mucor）链霉菌（Streptomyces）啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）假丝酵母（Candida）生物制药酶工程制药专家讲座第54页对于诱导酶发酵生产，在发酵培养基中添加适当诱导物，可使产酶量显著提升。

四、提升药用酶产量办法1、添加诱导物：生物制药酶工程制药专家讲座第55页不一样酶有各自不一样诱导物。然而有时一个诱导物可诱导生成同一酶系若干种酶，如β-半乳糖苷可同时诱导β-半乳糖苷酶、透过酶和β-半乳糖乙酰化酶3种酶(协同诱导)。同一个酶往往有各种诱导物，实际应用时可依据酶特征、诱导效果和诱导物起源等方面进行选择。生物制药酶工程制药专家讲座第56页（1）酶作用底物：乳糖诱导β-半乳糖苷酶青霉素诱导青霉素酶（2）酶反应产物：半乳糖醛酸诱导果胶酶纤维二糖诱导纤维素酶没食子酸诱导单宁酶诱导物种类：生物制药酶工程制药专家讲座第57页酶最有效诱导物。如：IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）对β-半乳糖苷酶诱导效果比乳糖高几百倍；蔗糖甘油单棕榈酸酯对蔗糖酶诱导效果比蔗糖高几十倍等。（3）酶底物类似物:生物制药酶工程制药专家讲座第58页分解代谢物阻遏阻遏作用产物反馈阻遏末端产物阻遏物酶催化反应产物分解代谢物控制阻遏浓度是解除阻遏、提升酶产量有效办法。2、控制阻遏物浓度生物制药酶工程制药专家讲座第59页

末端产物阻遏：可经过控制末端产物浓度使阻遏解除。

酶催化反应产物阻遏：可经过控制酶催化反应产物浓度使阻遏解除。解除：分解代谢物阻遏，可经过以下方法解除：控制培养基中葡萄糖等轻易利用碳源浓度补料分次流加碳源添加一定量CAMP。生物制药酶工程制药专家讲座第60页阳离子型离子型阴离子型表面活性剂两性离子型非离子型

3、添加表面活性剂生物制药酶工程制药专家讲座第61页因为离子型表面活性剂有些对细胞有毒害作用，不能用于酶发酵生产。

非离子型表面活性剂，如Tween、Triton等，可积聚在细胞膜上，增加细胞通透性，有利于酶分泌，所以可增加酶产量。另外，添加表面活性剂有利于提升一些酶稳定性和催化能力。生物制药酶工程制药专家讲座第62页产酶促进剂：是指能够促进产酶，但作用机理并未说明清楚物质。添加产酶促进剂往往对提升酶产量有显著效果。4、添加产酶促进剂生物制药酶工程制药专家讲座第63页五、药用酶分子修饰1、酶分子修饰：经过各种方法使酶分子结构发生一些改变，从而改变酶一些特征和功效过程称为酶分子修饰。生物制药酶工程制药专家讲座第64页提升酶活力，增加酶稳定性，消除或降低酶抗原性。2、酶分子修饰目标：生物制药酶工程制药专家讲座第65页经过改变酶分子中所含金属离子，使酶特征和功效发生改变方法称为金属离子置换修饰，简称为离子置换法。

3、酶分子修饰技术(方法)(1)金属离子置换修饰：生物制药酶工程制药专家讲座第66页

金属离子置换修饰法只适合用于原来在结构中含有金属离子酶。

用于酶修饰金属离子，往往是二价金属离子，如：Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等。生物制药酶工程制药专家讲座第67页酶液+EDTA等金属螯合剂→EDTA-金属螯剂→用透析、超滤、分子筛等方法除去→失活酶液+其它金属离子→酶活力升高，稳定性增强。金属离子置换修饰过程：生物制药酶工程制药专家讲座第68页例：锌型蛋白酶→钙型蛋白酶，酶活力提升20～30%；α-淀粉酶镁型、锌型→钙型，稳定性增强，酶活力提升3倍以上。生物制药酶工程制药专家讲座第69页利用水溶性大分子与酶结合，使酶空间结构发生一些精细改变，从而改变酶特征与功效方法称为大分子结合修饰法。(2)大分子结合修饰:生物制药酶工程制药专家讲座第70页右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等，这些大分子在使用前普通需经过活化，然后在一定条件下与酶分子以共价键结合，对酶分子进行修饰。大分子修饰剂：生物制药酶工程制药专家讲座第71页大分子结合修饰作用：水溶性大分子经过共价键与酶分子结合后，可使酶空间结构发生一些改变，使酶活性中心更有利于和底物结合，并形成准确催化部位，从而使酶活力得以提升。

.例：每分子胰蛋白酶用11分子右旋糖酐修饰后，酶活力可提升30%等。①、经过修饰提升酶活力：生物制药酶工程制药专家讲座第72页酶稳定性用半衰期来表示。酶半衰期：是指酶活力降低到原来二分之一时所经过时间。

②、经过修饰增加酶稳定性：用可溶性大分子与酶结合进行酶分子修饰，可在酶外围形成保护层，使酶空间构象免受其它原因影响，从而增加酶稳定性，延长其半衰期。生物制药酶工程制药专家讲座第73页③、经过修饰降低或消除抗原性抗体与抗原之间特异结合是因为它们之间特定分子结构所引发。采取酶分子修饰方法使酶结构产生一些改变，就有可能降低甚至消除其抗原性。例：聚乙二醇结合修饰后L-天冬酰胺酶，其抗原性可完全消除。生物制药酶工程制药专家讲座第74页要想取得理想修饰效果，必须确定最正确修饰剂种类和浓度、温度、pH值和反应时间。生物制药酶工程制药专家讲座第75页（3）肽链有限水解修饰酶蛋白肽链被水解后，可能会出现以下3种情况中一个：①酶活性中心被破坏，失去催化功效；②肽链一部分水解后，仍可维持活性中心完整构象，则酶活力仍可保持或损失不多；③肽链一部分水解除去以后，有利于活性中心与底物结合，酶活力提升。在后两种情况下，肽链水解在限定肽键上进行，称为肽链有限水解。生物制药酶工程制药专家讲座第76页利用肽链有限水解，使酶空间结构发生一些精细改变，从而改变酶特征和功效方法，称为肽链有限水解修饰。肽链有限水解修饰：生物制药酶工程制药专家讲座第77页有些酶原来不显示酶活力或酶活不高，利用一些含有高度专一性蛋白酶对它进行肽链有限水解修饰，除去一部分肽段或若干个氨基酸残基，就可使其空间构象发生改变，有利于活性中心与底物结合并形成准确催化部位，从而显示出酶催化活性或提升其酶活力。肽链有限水解修饰作用：①、显示或提升酶活力生物制药酶工程制药专家讲座第78页有些酶原来含有抗原性，这除了酶结构特点以外，还因为酶是大分子。蛋白质抗原性与其分子大小相关，大分子外源蛋白质往往出现较强抗原性，而小分子肽链或蛋白质，其抗原性较低或者无抗原性。所以，若将酶分子经肽链有限水解，其分子量减小，就会在保持其酶活力前提下，使酶抗原性降低，甚至消失。

②、降低抗原性：生物制药酶工程制药专家讲座第79页

酶蛋白侧链基团就是指组成蛋白质氨基酸残基上功效团。经过改变酶蛋白侧链基团而使蛋白质空间结构发生一些改变，从而引发酶特征和功效改变方法称为酶蛋白侧链基团修饰。

(4)酶蛋白侧链基团修饰：生物制药酶工程制药专家讲座第80页①氨基修饰剂：能使酶蛋白侧链上氨基发生改变化合物。主要有：二硝基氟苯、醋酸酐、亚硝酸等。②羧基修饰剂：可与酶蛋白侧链上羧基反应小分子化合物。主要有：乙醇-盐酸试剂、水溶性碳化二亚胺等

③胍基修饰剂：可与酶蛋白侧链上胍基缩合生成稳定杂环化合物。

普通是二羰基化合物。主要有：环己二酮、乙二醛、苯乙二醛等。惯用小分子侧链基团修饰剂：生物制药酶工程制药专家讲座第81页蛋白质半胱氨酸残基侧链中含有巯基。巯基在许多酶中充当活性中心催化基团，巯基可与另一巯基形成二硫键，对维持酶结构稳定性起主要作用。惯用有二硫苏糖醇、疏基醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠等还原剂以及各种酰化剂、烷基化剂等。④巯基修饰剂：生物制药酶工程制药专家讲座第82页蛋白质酪氨酸残基上含有酚基。酚基修饰法有：碘化法、硝化法和琥珀酰化法等。经酚基修饰剂修饰后，酚分子因为引入负电荷，因而增加了对带正电荷底物结协力，有利于酶催化功效发挥。

⑤酚基修饰剂：⑥分子内交联剂：用含有双功效团化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联，可使酶分子空间构象愈加稳定，从而也使酶催化稳定性增加。

生物制药酶工程制药专家讲座第83页（5）氨基酸置换修饰经过氨基酸置换修饰，能够提升酶活力或增加酶稳定性，更有利于酶应用。将肽链上某一氨基酸进行置换而引发酶蛋白空间构象一些改变，从而改变酶一些特征和功效，这种修饰方法，称为氨基酸置换修饰。

生物制药酶工程制药专家讲座第84页经过各种物理方法，使酶分子空间构象发生改变，从而改变酶一些特征和功效方法称为物理修饰。

（6）物理修饰：特点：不改变酶组分和基团，酶分子中共价键不发生改变，只是在物理方法作用下，副键发生一些改变和重排。生物制药酶工程制药专家讲座第85页第三节药物酶法生产生物制药酶工程制药专家讲座第86页用在半合成抗生素生产上。催化青霉素或头孢霉素水解生成6–氨基青霉烷酸（6–APA）或7–氨基头孢霉酸（7–ACA）。又可催化酰基化反应，由6–APA合成新型青霉素或由7–ACA合成新型头孢霉素。一、药品酶法生产中所用酶种类1、青霉素酰化酶：催化侧链水解和合成生物制药酶工程制药专家讲座第87页化学反应式生物制药酶工程制药专家讲座第88页不一样起源青霉素酰化酶对温度和pH值要求不一样。同一起源青霉素酰化酶在催化水解反应和催化合成反应时所要求条件各不相同，尤其是pH条件相差较大，操作时要控制好。普通说来，催化水解反应时，pH值为7.0~8.0,而催化合成反应时,pH值降低到5.0~7.0.生物制药酶工程制药专家讲座第89页2、β-酪氨酸酶

β-酪氨酸酶可催化L-酪氨酸或邻苯二酚生成二羟苯丙氨酸（DOPA，多巴）。多巴：一个神经传递介质，治疗帕金森氏综合症（英国医师Parkinson描述一个大脑中枢神经系统发生病变老年性疾病）。β-酪氨酸酶催化酪氨酸生成多巴条件为：pH3.5-6.0，温度30-55℃。另外，在催化转化时要添加抗氧化剂，

生物制药酶工程制药专家讲座第90页核苷中核糖被阿拉伯糖取代能够形成阿糖苷。阿糖苷含有抗癌和抗病毒作用。其中阿糖腺苷疗效显著。阿糖腺苷（腺嘌呤阿拉伯糖苷）可由核苷磷酸化酶催化阿糖尿苷（尿嘧啶阿拉伯糖苷）转化而成。而阿糖尿苷由尿苷（尿嘧啶核苷）经过化学方法转化而成。3、核苷磷酸化酶：生物制药酶工程制药专家讲座第91页无色杆菌（Acbrcmobacterlydicus）蛋白酶能够特异性地催化胰岛素B链羧基末端（第30位）上AA置换反应，由猪胰岛素（Ala-30）

人胰岛素（Thr-30），以增加疗效。4、无色杆菌蛋白酶：AA排列次序

A8

A9A10B30人

ThrSerIleThr猪

ThrSerIleAla

生物制药酶工程制药专家讲座第92页5、5′-磷酸二酯酶5′-磷酸二酯酶催化核糖核酸水解生成四种5′-核苷酸，5′-核苷酸用于心脏疾病、肝脏疾病等治疗。生物制药酶工程制药专家讲座第93页

PNP酶nNDP+RNAn

RNAn+1+pi

6、多核苷酸磷酸化酶（PNP酶）PNP酶催化核苷二磷酸聚合生成多聚核苷酸。式中NDP为核苷二磷酸，RNAn和

RNAn+1分别为含有n和n+1个核苷酸多核苷酸。生物制药酶工程制药专家讲座第94页若以肌苷二磷酸（IDP）和胞苷二磷酸（CDP）为底物，经过酶作用，可生成聚肌胞。聚肌胞是一个高效干扰素诱导剂，对慢性肝炎、带状疱疹、角膜炎等都有一定疗效。PNP酶可由大肠杆菌等各种菌株生产。生物制药酶工程制药专家讲座第95页1、依据欲制造药品结构特点，选择好原料、反应步骤及所使用酶或酶系。

二、酶选择与反应条件优化生物制药酶工程制药专家讲座第96页2、依据药品用途和要求，选择酶需经过一定步骤进行纯化，以到达产品要求。生物制药酶工程制药专家讲座第97页3、依据酶反应动力学特点，确定并优化反应工艺条件，包含底物浓度、酶浓度、温度、PH、激活剂浓度等。生物制药酶工程制药专家讲座第98页4、要求前体物质到达一定纯度要求并廉价易得，以提升产品质量，降低生产成本。生物制药酶工程制药专家讲座第99页三、酶和菌体固定化游离酶不足：（1）酶稳定性较差，在温度、PH值和无机离子等外界原因影响下，轻易变性失活。（2）难于回收利用，不但使成本较高，而且难于连续化生产。（3）酶反应后成为杂质与产物混在一起，不利于产物提纯和精制。生物制药酶工程制药专家讲座第100页固定化酶（ImmobilizedEnzyme）

:固定在载体上，并在一定范围内进行催化反应酶称为固定化酶。将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶过程称为酶固定化。

固定在载体上菌体或菌体碎片称为固定化菌体，它是固定化酶一个形式。生物制药酶工程制药专家讲座第101页（一）酶和菌体固定化方法

吸附法包埋法共价结正当交联法生物制药酶工程制药专家讲座第102页吸附法吸附法是经过载体表面和酶分子表面间次级键相互作用而到达固定目标方法。

生物制药酶工程制药专家讲座第103页物理吸附法(physicaladsorption)是经过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体方法。惯用载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。离子结正当(ionbinding)是指在适宜pH和离子强度条件下，利用酶侧链解离基团和离子交换基间相互作用而到达酶固定化方法（离子键）。最惯用交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其它离子交换剂还有各种合成树脂如AmberliteXE-97、DoweX-50等。离子交换剂吸附容量普通大于物理吸附剂。依据吸附剂特点分为两种：生物制药酶工程制药专家讲座第104页吸附法优点、缺点

优点：操作简单，可供选择载体类型多，吸附过程可同时到达纯化和固化目标，所得到固定化酶使用失活后能够重新活化和再生。

缺点：酶和载体结协力不强，易脱落，会造成催化活力丧失和沾污反应产物。

生物制药酶工程制药专家讲座第105页2、包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化方法称为包埋法。生物制药酶工程制药专家讲座第106页凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部微孔中，制成一定形状固定化酶或固定化菌体。（1）、凝胶包埋法聚丙烯酰胺包埋是最惯用包埋法它机械强度高，并能够改进酶脱落情况，在包埋同时使酶共价偶联到高聚物上，能够降低酶脱落。

海藻酸钠也能够用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化，操作简单经济。

K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。

胶原和明胶也是惯用包埋载体。生物制药酶工程制药专家讲座第107页2、微囊化包埋法微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业使用。微囊制备方法（1）界面沉淀法是一个简单物理微囊化法，它是利用一些高聚物在水相和有机相界面上溶解度较低而形成皮膜将酶包埋。（2）界面聚正当是用化学伎俩制备微囊方法。他所得微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。（3）表面活性剂乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜到达包埋目标一个方法。

生物制药酶工程制药专家讲座第108页包埋法优点、缺点优点：在于它是一个反应条件温和、极少改变酶结构不过又较牢靠固定化方法。

缺点：是只有小分子底物和产物能够经过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子酶并不适合。这是因为高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力造成固定化酶动力学行为改变，使活力降低。生物制药酶工程制药专家讲座第109页共价结正当是当前研究中最为活跃方法。

原理：借助共价键将酶非活性必需侧链基团和载体功效基团进行偶连。3、共价结合（偶联）法

生物制药酶工程制药专家讲座第110页（1）载体性质要求载体亲水，而且有一定机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合功效基团。

（2）偶联反应反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温缓冲溶液中。

（3）所选择偶联反应要尽可能考虑到对酶其它功效基团副反应尽可能少。

（4）要考虑到酶固定化后构型，尽可能降低载体空间位阻对酶活力影响。

共价偶联法中几个影响原因：生物制药酶工程制药专家讲座第111页共价偶联法优点、缺点：

优点：得到固定化酶结合牢靠、稳定性好、利于连续使用。