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文档简介
土壤中产淀粉酶芽抱杆菌淀粉酶活力测定
(3,5-二硝酸水杨酸显色法)实验目的：测定土壤中产淀粉酶芽抱杆菌的淀粉酶活性实验原理：酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。实验器材及试剂：高速离心机、分光光度计(1)粗酶液制备：以一环菌种接种于发酵培养基中，摇床培养，160rpm/min，37°C，48h。4000rpm/min李鑫20min，收集上清液即为待测粗酶液；⑵1mg/ml标准麦芽糖的制备：准确称量100mg麦芽糖，用蒸馏水准确定容到100ml；3,5-二硝基水杨酸试剂的制备：准确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL2mol/LNaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水定容到100mL，盖紧瓶塞，备用；0.1mlo/LpH5.6的柠檬酸缓冲液的制备准确称取4.62g柠檬酸和17.05g柠檬酸钠，用蒸馏水定容到800mL；1%淀粉溶液的制备准确称取1g淀粉于100mL0.1mol/LpH5.6的柠檬酸盐缓冲液中；标准曲线的绘制
表3标准曲线制作表1234567麦芽糖标准液00.20.611.41.82（mL）蒸馏水（mL）21.81.410.60.20麦芽糖含量/mg00.20.611.41.823,5-二硝基水杨1.51.51.51.51.51.51.5酸（ml）标准样液配置按上表配制完成，摇匀，置沸水浴中煮沸10min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以一号试管作为空白对照，520nm比色测定吸光度。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度为纵座标，绘制标准曲线。（7）测定取10mL具塞可第十关，预先洁净灭菌干燥、编号。按下表配制溶液，定容后摇匀，用分光光度计测定在520nm下的OD值。表4淀粉酶活侧定表空白对照1号菌①1号菌②4号菌①4号菌②粗酶液（mL）11111浓HCl（mL）10000预温：40°C水浴10min1%淀粉溶液11111（mL）精确保温：40C水浴5min浓HCl（mL）011113，5-二硝基水22222杨酸（mL）沸水浴10min⑻计算根据测到的OD值，在标准曲线中找到相应的麦芽糖量，并在上述条件下以单位体积样品在30min释放1mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位（MM）酶活力，按下式计算出淀粉酶的活力。淀粉酶活力=麦芽糖释放量（mg）*6*稀释倍数（9）实验预期结果麦芽糖标准曲线淀粉酶活力
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