代谢物识别与结构鉴定

代谢物识别与构造判定组员：周霞周雯迪郑梦琳第1页代谢物构造判定在新药开发过程主要地位预防潜在毒性测定是否和原药具有相同治疗作用测定对其他治疗有内在活性测定是否有代谢物和已知药品有关第2页药品代谢研究贯通于创新药品研发产业链始终，并在药品发觉及开发过程中起到越来越主要作用。建立可靠分析办法是研究药品体内代谢前提。在药品发觉和开发许多阶段，代谢物判定具有关键性作用。极性代谢物分离和保存如何在复杂数据中精确迅速地找到代谢物如何对代谢物构造进行确认，如何确定代谢位点A

CB

第3页联用技术放射性示踪第4页一、.联用技术第5页联用技术LC-MSLC-MS/MSGC-MSGC-MS/MSLC-NMR第6页LC-MS联用技术体内代谢物研究过程中，因待测物浓度太低，提取其纯品进行构造判定是不太也许。应用LC-MS联用技术可取得复杂混合体中单一成份质谱图，大大有利与药品代谢物分离与判定。第7页LC-MS联用技术伴随当代色谱联用技术发展，体内多种微量代谢产物分离、判定已成为一种连续过程，尤其是LC-MS样品前处理简单，一般不要求水解或衍生化处理，可直接用于药品及其I，Ⅱ相等极性较大代谢产物同步分离、判定。利用LC-MS技术不但可避免复杂啰嗦分离、纯化代谢产物工作，并且可分离判定难以辨识体内痕量代谢产物。第8页LC-MS联用技术

四极质谱仪（QMS）三重四极质谱仪（TQMS）四极-线性离子阱质谱仪（QTrap）四极-飞行时间质谱仪（Q-TOFMS）离子阱-飞行时间质谱仪（IT-TOFMS）代谢物判定中，常用与LC联用质谱仪器第9页LC-MS特点样品前处理简单，无需衍生化，适用范围广将色谱高分离能力与质谱高检测敏捷度、定性专属性集于一身伴随接口装置和离子化技术发展成熟，该技术在体内药品分析中逐渐发展成为一种常规分离检测办法第10页实例大鼠尿中人参皂苷Rd及其代谢物LC-MS研究第11页LC-MS实例目标：探讨人参皂苷Rd在大鼠体内代谢产物及转化途径。办法：选择SD大鼠6只,单剂量口服和静脉给予人参皂苷Rd,分段搜集给药前和给药后0～24h尿样,将尿样分时段合并后采取旋转薄膜蒸发浓缩,以固相萃取小柱纯化处理,采取高效液相色谱-串联飞行时间质谱进行检测。成果：通过比较给药前后TOF总离子流图,对尿中推测代谢物和标准物质出峰时间及有关化合物选择离子扫描二级质谱图进行了比较分析,成果在尿中发觉了7种代谢产物,系统分析了这些代谢产物代谢转化规律及也许构造。结论：大鼠尿中人参皂苷Rd主要转化途径为氧化、水解、结合及异构化代谢反应。第12页离子源(ESI)电压:-4kV,去簇电势(DP):-15V,聚焦电势(FP):-80V,去簇电势2(DP2):-15V,雾化气(NEB):0135L·min-1帘气(CUR):0120L·min-1负离子方式检测采取TOF扫描一级质谱扫描质量范围:400～1200选择离子扫描二级质谱进行测定色谱柱流动相其他质谱条件色谱与质谱条件为甲醇(A)-10mol·L-1乙酸铵(B)40min内由体积比50∶50线性梯度升至90∶10,40～55min维持A∶B=90∶10,等度洗脱15min流速:018mL·min-1分流比为1∶60柱温为25℃,进样量为20μLAgilentZorbaxSBC18(150mm×416mm,5μm)AgilentZorbaxSBC18(1215mm×211mm)预柱LC-MS实例第13页LC-MS实例MetabolizationpathwayofG-Rd第14页LC-MS实例FragmentpathwayofG-Rd第15页LC-MS/MS联用技术由于多数药品代谢物保存了原药分子骨架构造，或某些亚构造，因此，代谢物也许进行与原药相同裂解，丢失某些相同中性碎片或形成某些相同特性离子，用MS/MS分别进行中性丢失扫描、母离子扫描以及子离子扫描，即可迅速找到也许代谢物，并判定出构造。第16页实例LC-MS/MS法迅速高效检测尿液中尼古丁及其9种代谢物第17页LC-MS/MS实例以氘代尼古丁、氘代可宁、3-OH-氘代可宁、氘代尼古丁葡萄糖醛酸复合物、氘代可宁葡萄糖醛酸复合物、3-OH-氘代可宁葡萄糖醛酸复合物作内标,在LC-MS/MS大气压化学电离(APCI)离子化模式下,建立了迅速检测吸烟者尿液中尼古丁及其9种代谢物办法,并对19个实际样品进行了测试和鉴别分析(DA).试验前处理简单,色谱运行时间仅为3.8min.成果表白,尼古丁及其代谢物精密度在0.5%～5.5%之间,回收率在94%～109%之间,线性有关系数均大于0.995.DA分析充足区分开了不一样量吸烟者,深入有关性分析表白吸烟者24h尿液中尼古丁及其9种代谢物含量与卷烟抽吸量分析因子之间都有较强正有关性.第18页质谱检测采取APCI源正离子化模式气帘气压力设置为0.17MPa雾化气0.55MPa碰撞气0.04MPa离子源温度为550℃离子化电流设为3μA各代谢物多反应监测(MRM)参数见表色谱柱流动相其他质谱条件色谱与质谱条件流动相A为10mmol/L醋酸铵水溶液(pH6.8)流动相B为10mmol/L醋酸铵甲醇溶液流速0.5mL/min梯度洗脱条件:起始A为85%,到0.02min为5%保持至0.3min,0.32min变为85%保持至2min结束柱温为35℃为ShisheidoMGII柱(2.0mm×50mm,3μm)LC-MS/MS实例第19页LC-MS/MS实例第20页GC-MS联用技术气质联用技术是分析仪器中较早实现联用技术仪器。气相色谱分离效率高、定量精确，然而不足是定性较为困难，及时未知样品纯度较高，判定构造也不容易。质谱具有敏捷度高、鉴别能力强、响应速度快长处，但欠缺是对复杂得多组分样品分离能力。虽然商品化GC-MS联用仪器出现较早，在药品代谢研究中应用也较早，但GC法对样品极性和热稳定性有一定要求。因此，在GC-MS联用技术分析前，样品预处理极为主要。其代谢物热稳定性、挥发性、极性也许差异较大，需要根据详细情况对样品先进行水解处理或衍生化处理。第21页实例GC-MS/MS法测定人头发中大麻酚类及其代谢物第22页GC-MS/MS实例目标：建立同步检测头发中Δ9-四氢大麻酚（THC）、大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）和Δ9-四氢大麻酸（THC-COOH）分析办法。办法：头发样品加入氘代内标Δ9-四氢大麻酸（THC-COOH-d3），经碱水解后，以混合溶剂[V（正己烷）∶V（乙酸乙酯＝9∶1]进行提取，吹干，残留物经双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，用GC-MS/MS办法进行分析。成果：头发中THC-COOH、THC、CBN和CBD最低检出限分别为4、4、10和20pg·mg-1，各化合物在0.04～5ng·mg-1呈良好线性关系（r＞0.999），办法精密度、精确度均符合要求。结论：本办法选择性强、敏捷度高，适用于头发中CBD、CBN、THC及其代谢物THC-COOH分析，并成功应用于实际案例中。第23页质谱检测采取MRM模式，以一级质谱分析成果为基础，选择各目标物分子离子，优化碰撞能量CE），得到各目标物和内标二级质谱图。CBD、CBN、THC、THC-COOH

和THC-COOH-d3MS/MS见表色谱柱柱温其他质谱条件色谱与质谱条件程序升温：100℃保持1.5min，以升温速率25℃/min升温至280℃保持5min分流比2∶1；载气：氦气进样口温度：250℃检测器温度：250℃进样量：1μL。HP-1MS石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.1μm）GC-MS/MS实例第24页GC-MS/MS实例第25页LC-NMR联用技术近年来，LC-MS虽然得到普及推广，但MS本身不能提供足够分子构造信息，因此在实际使用LC-MS判定药品代谢物构造时，往往需要借助核磁共振（NMR）数据，才能顺利完成工作。目前，在仪器分析领域中NMR能够提供最大量分子构造信息，但该法要求样品为纯品，即在做NMR分析前必须做大量分离、纯化工作，这不利于样品迅速分析。假如在核磁共振仪器前配备一套色谱分离设备，使样品被LC分离后，直接进入NMR中进行扫描测定，就能够大大简化分析程序，提升样品分析速度。因此，将高分离能力色谱与能提供最丰富构造信息NMR在线联用是非常故意义。第26页LC-NMR联用技术但HPLC和NMR联用并不是两种技术简单组合：NMR检测敏捷度显著低于常规HPLC检测器，且作为HPLC流动相混合溶剂往往产生多重强溶剂峰而影响溶质峰正确而检测。由于技术上原因，如NMR敏捷度低、液相色谱使用氘代溶剂十分昂贵，溶剂信号对样品干扰等等使该联用技术受到限制。近年来LC/NMR联用技术在研究药品代谢产物,尤其是Ⅱ相代谢产物方面体现出了非常诱人前景,有关研究报告相继刊登。第27页LC-NMR实例布洛芬在人体内代谢物研究便是一种较好例子,健康男性注射400mg布洛芬后,搜集0～4小时尿液,经HPLC/NMR联用技术分析,图谱中清楚地显示出5个代谢产物:2-羟基布洛芬葡萄糖醛酸、2-羧基布洛芬葡萄糖醛酸、2-羟基布洛芬、2-羧基布洛芬和布洛芬葡萄糖醛酸。采取停顿流动模式技术能够得到纯2-羟基布洛芬1H-NMR图谱。第28页二、放射性示踪第29页放射性同位素示踪技术是利用放射性核素及其标识物作为示踪剂来硕士物体内多种物质吸取、分布、代谢、排泄(ADME)规律一门科学。第30页放射性示踪原理把用放射性核素标识物质A引入动物体，通过一段时间，从排出物或组织中分离出另一化合物B，具有相称数量上述标识核素，即可确定A在动物体内能够转变为B.第31页与被示踪物质有同一性，即放射性核素与其同种元素非放射性核素在化学和生物学行为上具有高度一致性，不致扰乱和破坏体内外生理过程平衡状态放射性示踪一与被示踪物质有可区分性，放射性核素原子核不停衰减，发出能被放射性探测仪所探测射线，从而实现对标识物定量及定位。二放射性同位素得以广泛应用于活性物质示踪主要依赖于其最主要两个特点第32页放射性示踪敏捷度高专属性强适用性广检测办法简便在药品ADME研究中得到了广泛应用。放射性同位素示踪技术在药品ADME研究中发挥着十分主要作用，美国FDA已将放射性同位素标识药品给药后药动学数据作为新药安全性评价主要根据，并制定了有关指南第33页放射性同位素示踪剂选择在药品ADME研究中，常用放射性同位素包括14C、3H、32P、33P、35S、125I、131I等。如今伴随小型正电子发射断层扫描(positronemissiontomography，PET)仪器发展，利用11C、13N、15O、18F等放射性核素进行ADME研究实例也日渐增多。第34页放射性同位素示踪剂选择放射性同位素YourTextHere实验目的操作者安全实验周期有时能够采取双标识或多标识放射性物质单一放射性同位素标识化合物毒性标识位置射线类型半衰期放射化学纯度比活度第35页放射性同位素示踪剂选择低能量14C和3H是药品ADME研究中最常用2种放射性核素。这2种核素半衰期分别为5730年和12.35年，由于其半衰期长，在试验周期中测得数据一般不需要作物理半衰期矫正，便于测量及成果计算。再者，14C和3H两种元素发射β－射线能量较低，易于防护，并可用液闪技术测得，试验操作及成果检测十分方便。另外，14C和3H还可通过放射自显影技术进行检测，显影清