(讲课)基因工程的基本操作程序课件

基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序11、目的基因的选择获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤:有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。1、目的基因的选择获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导2一、目的基因的选择获取:1、目的基因:主要是编码蛋白质的结构基因;也可以是具有调控作用的因子。2、获取目的基因的常用方法有哪些?从基因文库中获取。利用PCR技术扩增；化学方法直接合成。人工合成：从已有的物种中分离：把需要研究的基因称为目的基因。基因工程所述的目的基因：一、目的基因的选择获取:1、目的基因:主要是编码蛋白质的结3（一）、从基因文库中直接获取：1.什么是基因文库？将某一物种的生物不同的基因许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存起来，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，由这些含有不同基因片段的受体菌群组成的基因总和称为基因文库。

2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类种类基因组DNA文库：含有一个物种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一个物种生物的部分基因，如：cDNA文库（一）、从基因文库中直接获取：1.什么是基因文库？将某一物43.如何构建基因文库或构建基因文库遵循原则：简单的说：就是根据目的基因的有关信息进行分类。如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、以及基因翻译产物等特性来构建基因文库。4.构建基因文库的方法：

①直接分离法(鸟枪法)：②反转录法：3.如何构建基因文库或构建基因文库遵循原则：简单的说：就是根5提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库

①.直接分离法(鸟枪法)提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片6某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶②反转录法：cDNA的合成流程图解某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体7基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较：

文库类型

cDNA文库

基因组文库文库大小

较小

较大基因中有无启动子

无

有基因中内含子

无

有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较：文85.如何从基因文库中寻找目的基因：简单的说：根据建立基因文库时的分类索引来寻找。如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、以及基因翻译产物等特性来构建基因文库。5.如何从基因文库中寻找目的基因：简单的说：根据建立基因文库9原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游不能编码蛋白质可调控遗传信息的表达(调控序列)编码蛋白质(编码序列)原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游10原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶是由多个肽链构成的蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合,催化转录形成RNA。原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位11与RNA聚合酶结合位点AGGUCACGUCGAGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCRNA聚合酶RNA聚合酶RNA聚合酶与RNA聚合酶结合位点AGGUCACGUC12真核细胞的基因结构一个典型的真核细胞基因结构示意图编码区含有：能够编码蛋白质的序列(外显子)不能编码蛋白质的插入序列(内含子)非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345真核细胞的基因结构一个典型的真核细胞基因结构示意图编码区含有13真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区下游调控遗传信息的表达(调控序列)外显子(能编码蛋白质)内含子(不能编码蛋白质)真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区下游调控遗传信14非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345加工转录前体RNAmRNA加工非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子1215一个典型的真核细胞基因结构示意图非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345原核细胞基因真核细胞基因相同点不同点原核细胞基因与真核细胞基因的比较都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成。编码区是连续的编码区是间隔的，是不连续的一个典型的真核细胞基因结构示意图非编码区非编码区编码区与RN161、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的（）A、染色体DNA

B、线粒体DNAC、总mRNA

D、tRNA2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是（）A、某生物的全套基因就是一个基因文库；B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库；C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库；D、含有一个生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库。AC1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的（）2、目的基17（二）利用PCR技术扩增目的基因：是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。PCR——聚合酶链式反应:（二）利用PCR技术扩增目的基因：是一项生物体外复制特定DN18PCR技术:PCR扩增仪DNA双链复制一段已知目的基因的核苷酸序列模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子.原理：前提：原料:PCR技术:PCR扩增仪DNA双链复制一段已知目的基因的核苷19

过程：高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）重复循环预变性（增加DNA变性的概率）过程：高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单链20

PCR技术具体过程：a、高温DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成_________b、低温退火复性（55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、适温延伸（70℃-75℃）：在耐热DNA聚合酶（Taq）的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA。双链DNA链在生物体内双链DNA解链能采用高温吗？PCR技术具体过程：a、高温DNA变性（90℃-95℃）：21PCR(多聚酶链式反应） 结果：方式:以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。PCR(多聚酶链式反应） 结果：方式:以_____方式22PCR技术扩增与DNA复制的比较：PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子PCR技术扩增与DNA复制的比较：PCR技术DNA复制相同点23例、多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是：（）A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现；B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成；C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸；D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高。答案；C例、多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技24目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：（3）、化学合成方法：目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA反转录合25二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1、构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2、操作环境：体外操作二、基因表达载体的构建1、构建基因表达载体的目的：使目的基因263、基因表达载体的组成：目的基因；启动子；终止子；标记基因。3、基因表达载体的组成：目的基因；27启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合28运载体与基因表达载体等同吗？：1、不同点：⑴“运载体”泛指基因工程操作中能将外源基因送达受体细胞的工具。如细菌质粒等。

“运载体”强调它的运载基因功能，只要能运载基因就算是运载体。

⑵“基因表达载体”，是指能够运输目的基因、并且要保证目的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。它强调的不仅是运输，更重要的是运输后能够使目的基因表达。基因表达载体的构成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。2、相同点：

“基因表达载体”是在”运载体”的基础上构建成的；运载体与基因表达载体都含有复制原点及外源基因。运载体与基因表达载体等同吗？：1、不同点：2、相同点：29①运载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在运载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。⑤复制原点与启动子：复制原点是DNA复制的固定起始点，启动子是位于结构基因上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA相结合并具有转录起始的特异性。简单的说：一个是DNA复制开始，一个是转录开始。注意：①运载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分D30例、科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子（抗虫基因首端），导人棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子（抗虫基因末端），导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。由以上过程推知，基因表达载体应具备的结构是（）A、目的基因、启动子B、目的基因、终止子C、目的基因、启动子、终止子D、目的基因、启动子、终止子、标记基因答案:D例、科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力31例、为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。

据图回答：①图中基因组文库

（填“小于”、“等于”或“大于”）cDNA文库。例、为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻32②B过程需要的酶是

；③目的基因Ⅰ和Ⅱ除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中

和

为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是

。逆转录酶DND

cDNA

耐高温②B过程需要的酶是

；③目的基因Ⅰ和Ⅱ除33三、将目的基因导入受体细胞——转化：（一）转化概念：（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。三、将目的基因导入受体细胞——转化：（一）转化概念：（二）34农杆菌特点及转化原理：农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的一段特殊的T-DNA（可转移的DNA）可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法：农杆菌特点及转化原理：农杆菌是一种在土壤中生活的微生35过程过36基因枪转化法：它的主要原理是将含目的基因的载体包被（吸附）在微小的金属微粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化。（2）基因枪法：基因枪转化法：它的主要原理是将含目的基因的载体包被（吸附）37（3）花粉管通道法：花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化.

（3）花粉管通道法：花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花382、将目的基因导入动物细胞：提纯含目的基因表达载体从母体取卵（受精卵）通过显微注射仪注射基因表达载体对含目的基因的受精卵进行早期体外培养移植母体动物输卵管或子宫内①方法：显微注射法②程序：发育具有新性状动物2、将目的基因导入动物细胞：提纯含目的从母体取卵（受精卵）通39①原核生物特点：用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子。②方法：3、将目的基因导入微生物细胞——吸附转化繁殖快、单细胞、遗传物质少。③条件：

缓冲液：Mg2+、ATP辅助因子、DTT（二硫苏糖醇）、血清蛋白。温度：12——160c12---16小时；或7—80c2——3天。受体细胞能用结核杆菌吗？①原核生物特点：用Ca2+处理细胞感受态细胞40（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因：

（1）方法:DNA分子杂交DNA分子杂交：来源不同的两条单链核酸分子,通过碱基互补形成异源双螺旋分子的过程。四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功（2）过程:A、首先取出转基因生物的基因组DNA；B、取含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,该段DNA称作基因探针；C、使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的41基因探针：指带有放射性标记，能与目的基因互补的已知核苷酸序列的一段单链DNA或RNA。基因探针的条件：

单链DNA或RNA；有易被检测的标记；高度特异性。基因探针种类：

基因DNA探针；cDNA探针；RNA探针。基因探针：指带有放射性标记，能与目的基因互补的已知核苷酸序列42归纳步骤归纳步骤43DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物442、检测目的基因是否转录出了mRNA①方法:分子杂交②过程:用DNA探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。分子杂交用被标记的目的基因探针从转基因生物中提取mRNA显示杂交带—转录成功

未显示杂交带—转录失败

2、检测目的基因是否转录出了mRNA①方法:分子杂交②453、检测目的基因是否翻译成蛋白质：方法:抗原—抗体杂交过程：目的基因大肠杆菌———蛋白质———动物体内———抗体（－）转基因生物———蛋白质（抗原）免疫注入表达表达是否特异性结合大肠杆菌实验动物转基因生物分别导入3、检测目的基因是否翻译成蛋白质：方法:抗原—抗体杂交过程：46归纳步骤（二）、鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等归纳步骤（二）、鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活47(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原—抗体杂交(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检48归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因49练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的

处，DNA连接酶作用于

处。（填“a”或“b”）aa练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量50练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和

法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用

技术，该技术的核心是

和

。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的

作探针进行分子杂交检测，又要用

方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养脱分化和再分化耐盐基因一定浓度盐水浇灌练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量51例、2009年10月，我国自主研发的转基因抗虫水稻“华恢1号”获得农业部颁发的安全证书。下图表示该抗虫水稻主要培育流程，据图回答：

（1）④过程应用的主要生物技术是

。例、2009年10月，我国自主研发的转基因抗虫水稻“华恢1号522）组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图（部分基因及部分限制性内切酶作用位点），据图分析：

①人工改造时，要使抗虫基因表达，还应插入

2）组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。下图是天然土壤农53

②人工改造时用限制酶Ⅱ处理，其目的是：第一，去除质粒上的

基因，保证T－DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于

。第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等。

②人工改造时用限制酶Ⅱ处理，其目的是：第一，去除质粒上的

54③若用限制酶Ⅰ分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒。分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的现象是在含

能够生长，而在含

中能生长。

③若用限制酶Ⅰ分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因的DNA55答案：（1）植物组织培养（2）①启动子②tet和tmr目的基因（或外源DNA）准确插入③卡那霉素的培养基四环素的培养基

解析：（1）④过程表示植物细胞组织培养成植物体。（2）①基因表达载体应含有启动子、终止子、目的基因、标记基因。②从图看出限制酶Ⅱ能破坏tet和tmr。③由图看出限制酶Ⅱ已将四环素抗性基因破坏。答案：（1）植物组织培养561）以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来C练习：1）以下说法正确的是572）不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD练习：2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是D练习：583）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A练习：3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A练习：594）有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D练习：4）有关基因工程的叙述正