《生物工艺学》基因工程菌的发酵-课件

生物工艺学

第十四章基因工程菌的发酵2ppt课件第一节工程菌的来源和应用一、何谓基因工程基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。3ppt课件二、工程菌的获得确定目的产物。找出产该产物的细胞。将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNA分子。将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。4ppt课件三、工程菌应具备的条件发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。菌株不是致病株，也不产内毒素。代谢控制容易进行。能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。5ppt课件四、工程菌的应用1，基因药物红细胞生成素胰岛素干扰素乙肝疫苗生长激素粒细胞巨噬细胞集落刺激因子6ppt课件2，其它发酵产品酶制剂氨基酸（苏氨酸、色氨酸）抗生素7ppt课件第二节工程菌的培养就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。8ppt课件一、安全问题关于基因工程的社会问题，必须提到它的潜在危险性。经过重组的菌和质粒一旦用于工业化生产，就不可避免地进入自然界。这些菌能间接地危害人体健康，使治疗药物失去效用，污染环境等。因此，安全问题是极其重要的。9ppt课件1974年，提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性的问题。后来，制定了有关DNA重组实验的准则，其目的是保证实验的安全和推动重组DNA的研究。这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定，采用物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。10ppt课件物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。11ppt课件二、工程菌培养的特点工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为低。为提高工程菌体表达效率，需采取适当措施，提高重组DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表达产物自细胞内向细胞外分泌。工程菌体的原宿主通常是某些培养物质(如某种氨基酸或维生素等)的缺陷型，有些基因工程细胞生产过程亦产生某些抑制细胞生长的代谢物。在培养过程中应考虑控制培养液营养成分及其浓度，同时采取措施，消除抑制细胞生长的代谢物，以保证细胞正常生长。12ppt课件三、工程菌的培养工程菌的营养控制质粒稳定性重组质粒拷贝数的控制及表达效率13ppt课件1，底物浓度的控制在基因工程茵培养过程，至少要遵循PI级物理防护的规定，因此必需进行菌体的高密度培养。从生物安全性考虑，培养的基因工程菌通常是维生素或氨基酸的营养缺陷型突变株。14ppt课件2，质粒稳定性（1）质粒不稳定的类型分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。15ppt课件（2）影响质粒稳定的因素与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响宿主对质粒稳定的影响质粒拷贝数重组质粒的表达对质粒稳定性的影响16ppt课件（3）使质粒稳定的措施组建合适载体选择适当宿主施加选择压力抗生素添加法抗生素依赖变异法营养缺陷型法控制基因过量表达控制培养条件17ppt课件3，表达效率及质粒拷贝数控制在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。18ppt课件第四节培养装置与产物的提取工程菌的培养与普通微生物的培养方法类似。在进行以工业化为目的的DNA重组实验，以及为生产异种基因产物而培养重组菌时，当然应采用简便易行的培养系统。现在多半使用大肠杆菌为宿主，而在一般的通气搅拌罐中大肠杆菌能生长良好。19ppt课件一、培养罐作为基因重组体的培养装置，与一直沿用的通气搅拌培养罐要有区别，即不仅要防止外部微生物侵入罐内，还必须采用不使培养物外漏的培养装置。按实验准则，可把这类密闭型通气搅拌式培养罐划分为操作液量20L以上和20L以下两种。现今使用的微生物培养装置，按其灭菌法又可分两类。一是在高压灭菌器中进行培养基及培养罐的灭菌，罐本身通常是玻璃制的，容量在10L以下的居多；另一类是20L以上的培养罐，一般为不锈钢制品，多采用通新鲜蒸气进行灭菌。20ppt课件二、工程菌外漏的防范首先应了解培养微生物在普通通气搅拌罐中可能发生外漏的部位和操作。归纳起来有：排气，机械密封，接种，取样，培养后的灭菌(通入湿热蒸气)，排液(输至下一工序)。21ppt课件1，排气22ppt课件2，机械密封考虑培养液外漏的情况，培养基因工程菌时，以用上部搅拌的双机械密封为好。23ppt课件3，取样普通培养罐的取样管道在取样时会流出样品。取样后对样品管道灭菌时，未灭菌的培养液污水被排至排水管内。对此，必须采取措施，如用取样工具进行取样。此法可在培养液不接触外界的条件下取样。24ppt课件4，培养后的灭菌培养后对培养液和管道等进行灭菌时，一开始流出的末灭菌排水有可能存在活的重组菌。取样、排液的管道中能产生这类排水，因此，一定要另行安装排水管并与废液灭菌贮槽等相连接，以便排放污水。25ppt课件5，接种向罐内直接接种的方法是不安全的。简单的安全接种法是将种子瓶与培养罐以管相连接后，用无菌空气加压压入的方法。另一种方法是先把种子液在安全柜内移至供接种用的小罐内，再将其与培养罐连接，用蒸汽对连接部分灭菌后，把种子罐中的种子液接入培养罐内。26ppt课件6，排液培养后要将培养液输送至贮罐等下一道工序，这时也有可能产生气溶胶和重组菌的扩散。安全的方法是在培养开始前就将排液口与下段工序相连接并进行灭菌，这样培养一结束即可直接输送培养液。如果排液口未与下段工序相连那就应与连结废液灭菌罐的排水管道相接，这样就安全了。27ppt课件三、培养罐的管道布局下图表示重组菌培养罐(P2、P3级)的整体流程图。重组菌培养罐中，凡有可能外漏重组菌的部分都与排污管道相连。图中所示的管路能分离并排出污染重组菌的污水。28ppt课件四、基因工程产品的提取和精制

传统的发酵产品和基因工程产品在提取和精制上的不同，主要表现在下列两方面：传统发酵产品多为小分子(工业用酶除外，但它们对纯度要求不高，提取方法较简单)，其理化性能，如平衡关系等数据都已知，因此放大比较有根据；相反，基因工程产品都是大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。基因工程产品大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎，增添了很多困难。29ppt课件另外，对于基因工程产品，还应注意生物安全(biosafety)问题，即要防止菌体扩散，特别对前面几步操作，一般要求在密封的环境下操作。例如用密封操作的离心机进行菌体分离时，整个机器处在密闭状态，在排气口装有一无菌过滤器，同时有一根空气回路以帮助平衡在排放固体时系统的压力，无菌过滤器用来排放过量的气体和空气，但不会使微生物排放到系统外。30ppt课件生物反应器的比拟放大制作人：FranklinGangChen2003年11月组员:罗旭余虎姚鹏刘朝芬杨喆谢青兰31ppt课件生物反应器的比拟放大（一）生物反应器简介（二）生物反应器放大的目的（三）生物反应器的放大原则（四）生物反应器的放大方法（五）发酵罐的比拟缩小（六）生物化工发展现状与未来32ppt课件生物反应器简介生物反应器是生物技术开发中的关键设备，每一种生物反应获得的产品都离不开它。一项生物技术能否实现产业化，很大程度上依赖于所用反应器的效率。在生物反应器的设计与操作中，至少要考虑以下两方面的问题：（1）生物化学和生物能量学的问题（2）该技术所涉及的生物反应过程33ppt课件生物反应器简介生物反应器是使生物技术转化为产品、生产力的关键设备，其在生物过程中处于中心地位。生物工业中使用的生物反应器有多种形式。传统生物工业中使用的生物反应器称为“发酵罐”（fermenter）。上个世纪70到80年代，“生物反应器”这一称呼开始出现，并逐渐被人们广泛接受和大量运用。生物反应器的种类比较多，不仅包括传统的发酵罐、酶反应器，还包括固定化酶或细胞反应器、动植物细胞培养反应器和光合生物反应器等等。34ppt课件35ppt课件生物反应器放大的目的一个生物反应过程的开发，通常是在实验室规模、中试规模优化研究的基础上最后才在大型生产设备中投入生产的。但在不同大小的反应器中进行相同的生物反应时，在生物反应器质量、热量和动量传递上的差别，有可能导致反应速率以及反应时具体过程的差异，从而导致反应的异化。因此，生物反应器的比拟放大是生物化学工业中的一个重要研究课题。36ppt课件生物反应器的放大原则（一）生物反应器的类型很多，所适用的体系也各异，因此生物反应器的放大是比较复杂的。下面就介绍一些放大准则。（1）几何相似即按小的与大的装置各部分几何尺寸比例大致相同放大。但是，为了避免设备直径过大，大设备的高径比往往大一些。（2）恒定等体积功率放大由Pg/V恒定而确定搅拌转速。37ppt课件生物反应器的放大原则（二）（三）恒定传氧系数kLa放大这个方法抓住了传氧这一关键因素，目前应用很多。具体应用中要注意几个问题。

1.小试中要测得准确的kLa值，选择合适的计算公式。

2.注意各计算kLa公式在放大中参数的变化及适用范围。

3.按照计算P0/Pg选择通气比，计算Vs求kL来计算38ppt课件39ppt课件生物反应器的放大原则（三）（四）恒定剪切力恒定叶端速度放大剪切力与搅拌桨叶端速度成正比，在恒定体积功率放大时一般维持n3d2不变（n为搅拌桨转速、d为搅拌桨直径）（五）恒定的混合时间tM放大另外，还有人主张考虑NRe及动量因子来放大等，这里就不一一介绍了。40ppt课件生物反应器的放大方法生物反应器的比拟放大，要对具体情况做具体分析。根据不同的需要来确定放大准则，再选取合适的方法。具体的放大方法主要有以下几种：（一）以kLa为基准的比拟放大法（二）以Po/V相等为准则的比拟放大（三）其他的比拟放大方法41ppt课件以kLa为基准的比拟放大法有的菌种在深层发酵时耗氧速率很快，因此溶氧速率能否与之平衡就可能成为生产的限制性因素。耗氧速率可以用实验法测定。在小型试验发酵罐里进行发酵过程，用适当的仪器记录发酵液中的溶氧浓度。42ppt课件43ppt课件以Po/V相等为准则的比拟放大对于溶氧速率控制的非牛顿发酵液系统，把Po/V相等作为比拟放大的准则就非常方便，同时也避免了微生物参与所带来的计算kLa的困难。值得注意的是，Po/V与传质系数之间的确存在着重要的关系，但Po/V相等并不意味着kLa相等。二者之间没有必然的联系。44ppt课件其他的比拟放大方法（一）恒周线速度

丝状菌发酵受剪率、特别是搅拌叶轮尖端线速度的影响较为明显。如果仅仅保持kLa相等或Po/V相等，可能会导致严重的失误。在Po/V相等的条件下，D/T比越小，造成的剪率越大，也有利于菌丝团的破碎和气泡的分散，这对于产物抑制的发酵有重要意义。所以，对于这类发酵体系，搅拌涡轮周线速度也被认为是比拟放大的基准之一。45ppt课件其他的比拟放大方法（二）恒混合时间

混合时间的定义是把少许具有与搅拌罐内的液体相同物性的液体注入搅拌罐内，两者达到分子水平的均匀混合所需要的时间。混合时间主要与发酵液的粘度有关，通常，低粘度的液体混合时间要少于高粘度的液体。另外，放大罐的体积越大，混合时间就越长。46ppt课件其他的比拟放大方法由此可以看出，比拟放大虽然必须以理性知识为基础，但也离不开丰富的实际运转经验，特别是对于非牛顿流体发酵系统尤其如此。直到最近，比拟放大的现状仍然如此。47ppt课件发酵罐的比拟缩小在不少情况下，大型的生产规模的发酵罐是已有的，而用实验室的摇平去筛选生产用菌株。但有的时候，摇瓶中的环境条件与大型发酵罐有很大的不同，这就导致很多生产与实验中的不符合。比拟缩小就是将现有的生产规模发酵罐比拟缩小至实验室规模。目的就是在实验室规模中实现大型反应器的微生物生长活动的环境条件。这就为现有的生产规模提供了优良的菌种筛选和选育的场所，也为工艺条件的优化提供服务。比拟缩小的原理、方法与比拟放大相同。48ppt课件生物化工发展现状与未来（一）国外生物化工产业发展趋势（二）我国生物化工主要产品发展方向（三）国内外的生物公司49ppt课件国外生物化工产业发展趋势生物化学转化与传统的化学合成相比，具有原料易得、反应条件温和、选择性高和环境污染小的优点。特别是现代生物技术的发展，已使生物化工成为21世纪最高生命力的产业。生物技术是振兴化工的一个重要方面。美国确定2020年化学工业技术发展方向是：以催化为中心的化学合成技术应用于农业、医药和食