柠檬酸发酵课件

柠檬酸发酵

武汉科技学院2009柠檬酸简介柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三羧酸，英文文献俗名citricacid，分子式C6H8O7。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。用途柠檬酸主要应用于食品工业,作为调味料,酸化剂或防腐剂,约占总产量的60%;用于医药工业作为许多药品的合成原料、补血剂、输血剂、酸化剂、防腐剂等约占总产量的12%;用于化学工业是许多化学产品的合成原料,如柠檬酸的醋类,包括柠檬酸三丁醋、乙酞柠檬酸三丁酷、柠檬酸三乙醋、三辛醋等等,都是无毒增塑剂用来制造食品包装物、玩具等。柠檬酸盐类,如柠檬酸钠用作洗涤剂的助剂,以代替造成公害的三聚磷酸钠。用于冶铜废气脱硫以回收硫磺免除公害。用于清洗锅炉及各种热交换器等。柠檬酸钱盐除了作防腐剂外还应用于染料工业,约占总产量的20料,如柠檬酸的醋类,包括柠檬酸三丁醋、乙酞柠檬酸三丁酷、柠檬酸三乙醋、三辛醋等等,都是无毒增塑剂用来制造食品包装物、玩具等。柠檬酸盐类,如柠檬酸钠用作洗涤剂的助剂,以代替造成公害的三聚磷酸钠。用于冶铜废气脱硫以回收硫磺免除公害。用于清洗锅炉及各种热交换器等。柠檬酸钱盐除了作防腐剂外还应用于染料工业,约占总产量的20%。其他方面如在混凝土中加人适量的柠檬酸可作缓凝剂在电镀工业中可代替山萘（氰化钾）实行无毒电镀。在皮革工业中用于脱灰印染、油墨、晒图、化妆品等都需要它。约占总产量的8%.产业分析目前，中国有柠檬酸生产厂近百家，总年产能力约80万吨，是全球最大的柠檬酸生产国和出口国，近两年，出口量更是超过国内总产量的90%，出口依赖严重。出口量在全球柠檬酸贸易总量中的比重超过60%。柠檬酸产量和出口世界居首

我国柠檬酸产量和出口量已连续多年居世界第一。2005年，我国柠檬酸类产品产量63万吨，占世界总产量的44%;国内总产量的约80%出口国外，2005年出口量48.51万吨，占世界贸易总量的50%。2006年柠檬产量达到66万吨，出口60万吨;2007年，国内柠檬酸及柠檬酸产量76万吨，共出口70.83万吨，2006年和2007年两年国内柠檬酸出口超过总产量的90%，出口依赖严重。柠檬酸市场需求广泛

全球柠檬酸的年需求量约为130万吨左右，且以年5%-7%的速度递增。2007年，全球柠檬酸需求继续以3%的幅度增长。随着中国人民生活水平的提高，也带动了柠檬酸国内需求的大幅度增加。

我国柠檬酸主要消费于食品和饮料市场，其他消费领域包括医药、化妆品原料、洗涤剂原料以及工业领域，其中食品和饮料占70%左右，其他领域约30%。我国柠檬酸国内需求量增长不大，国内产量主要出口到国际市场。目前，生产厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原生物化学集团公司（生产能力为12.0万吨/年）、江苏无锡罗氏中亚柠檬酸有限公司（生产能力为4.0万吨/年）、安徽华源生物药业有限公司（生产能力为3.5万吨/年）等。存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设备利用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。4、反倾销调查是中国柠檬酸出口的最大障碍

中国柠檬酸屡遭国外反倾销，导致出口受阻。早在2000年，美国就对中国产柠檬酸进行反倾销调查，中国胜诉;2003年3月，泰国对从中国进口的柠檬酸开始反倾销调查，泰国起诉方指控中国柠檬酸倾销幅度达45%;2003年5月14日，乌克兰对中国生产的柠檬酸进行反倾销调查，并从10月15日起，对中国产柠檬酸征收1305的临时反倾销税，为期4个月。

2007年1月19日，南非国际贸易管理委员会在其官方网站发布声明，宣布将对来自中国的柠檬酸产品进行反倾销调查。

2007年9月4日，欧委会在《欧盟官方公报》上宣布，应欧洲化学工业协会7月23日递交的申请，欧委会决定对原产于中国的柠檬酸进行反倾销立案调查。5人民币持续升值，出口企业损失较大

人民币升值影响是影响我国柠檬酸出口的又一大因素，汇率升值造成出口产品的非主动性提价，一定程度上影响柠檬酸的出口量值。

6、产业政策风险加剧

(1)限制粮食加工

2007年9月国家发展与改革委员会出台的《关于促进玉米深加工业健康发展的指导意见》提出，"十一五”期间，玉米深加工结构调整的重点是提高淀粉糖、多元醇等国内供给不足产品的供给，稳定以玉米为原料的普通淀粉生产，控制发展味精等国内供需基本平衡和供大于求的产品，限制发展以玉米为原料的柠檬酸、赖氨酸等供大于求、出口导向性产品，以及以玉米为原料的食用酒精和工业酒精。政策极大限制了柠檬酸行业的未来发展空间。

(2)节能减排生产

"十一五”期间，国家将逐步淘汰落后造纸产能650万吨，落后酒精产能160万吨，落后味精产能20万吨，落后柠檬酸产能8万吨;实现减排化学需氧量(COD)124.2万吨。2007年，国家发改委、环保总局下发通知，决定依法对不符合法律法规、产业政策的规定，环保评审不达标、超标或超排污许可证要求排放的落后柠檬酸生产能力实施淘汰。分年度工作任务2006-2009年:分别淘汰落后柠檬酸产能3.3万吨、2万吨、1.9万吨和0.8万吨;减排化学需氧量(COD)3.2万吨。发展历史1952年美国Miles实验室采用较为先进的深层发酵工艺实现了工业化大生产中国菌种选育屡结硕果20世纪70年代，上海工微所以酒精生产上所用的固体曲菌种宇佐美曲霉为出发菌，经60Co-γ射线及氮芥诱变处理，以薯干为原料进行柠檬酸菌种筛选，获得我国第一代柠檬酸生产菌——宇佐美曲霉N558，N558产酸水平6~7%，转化率70~80%，周期120小时采用在筛选平板培养基之中添加10%柠檬酸的方法，从土壤中筛选出野生黑曲霉628，经60Co-γ射线8~10万伦辐射之后，通过常规的变色平板即在平板之中加入0.04%的溴酚蓝，采用比较显色圈和菌落的直径等方法，选育出了黑曲霉D353，此菌种发酵产酸8~9%，转化率80~90%，周期96~120小时朱享政等以D353为出发菌株，用60Co-γ射线诱变，采用以柠檬酸盐为唯一碳源的培养基“富集”培养，用葡萄糖合成培养基分离筛选，确定了筛选乌头酸酶活性低的菌种的筛选方向，即将诱变处理的孢子悬浮液，先在柠檬酸为唯一碳源的合成培养基中培养，将能迅速利用柠檬酸的孢子过滤除去，再进行平板分离得到利用柠檬酸迟缓的菌种，结果成功选育到黑曲霉D5016和黑曲霉3008，此二菌在蔡氏琼脂平板之上生长均相当缓慢，分生孢子极为稀疏，工业生产中此二菌的产酸分别达到9~10%和11~12%。朱享政等为了将3008用于葡萄糖母液发酵，又进行了连续诱变，即用硫酸二乙酯（EDS）处理后再经Co60-γ射线辐照，根据柠檬酸高产菌株不产孢子和菌球较小的经验，筛选出了Co827菌种。Co827是我国柠檬酸发酵史上最重要的菌种之一，一直沿用至今，发酵产酸13%~14%，转化率95%以上，发酵周期64小时天津工微所在柠檬酸菌种研究方面也很成功，其中T419的产酸水平也很高。于云岭等以T576为出发菌株，经氮芥处理和紫外线照射，均未获得满意结果，最后经Co60-γ射线多次处理，得到一株以淀粉为原料的新菌株TD-01，产酸达20.04%，转化率为97.28%，发酵周期为96小时如江南大学金其荣等人选育出了耐40℃高温而产酸能达到13%、转化率为92.9%的菌种国外Rugsaeel.S等人以wu-2223L为出发菌株，经过诱变选育出了放线菌酮敏感突变株，并且证实此菌株具有增强的蛋白质合成能力，使初糖为120mg/ml的摇瓶基质培养基之上能够聚集2.4~3.2倍于原菌的柠檬酸。GuptaSanjay等人以KCU520为出发菌株选育了对锰离子有拮抗作用的突变株GS-III，在锰离子含量高达1.5PPM时仍能高产柠檬酸。此外通过融合而获得的二倍体菌株也有可能获得高产菌株，据报道Kimura等通过细胞融合法选育的菌株比亲株产酸提高1.2倍，而且利用糖的速度快，生酸速度快，各项指标均高于初始菌株[19]。Kimura等人还将黑曲霉l和绿色木霉TrichodermaViride融合成功，构建了高产菌株。近年来，关于2-脱氧葡萄糖代谢的研究发展很快，有了不少成功的报道。Fiedurek等人首先对柠檬酸产生菌进行了此方面的研究，并得了良好的效果[21]。1998年Watanabe等人把2-DG抗性突变株进一步应用于生产，产酸从77.9g/L增加到了98.7g/L。1998年Pragui等人以NLAB280菌为出发菌株，经过γ射线照射选育出了2-DG抗性突变株RP7，可产生120g/L的柠檬酸，而对照菌株只能产80g/L的柠檬酸。发酵时间由原来的10天缩短到6~7天，对糖的摄取速率也变得更快结合我国柠檬酸工业情况,应注意以下诸多方面继续选育优良菌种,提高菌种抗氮、抗变质薯干性能,提高稳定发酵水平。改革发酵原料结构,除淀粉外,开发小麦、玉米等多种大量生产作物作为原料,应用于柠檬酸生产。为了适应生产大型化,要改进目前抱子培养方法,开发干抱子培养制造技术,并使之工业化生产,供各柠檬酸厂使用。这样就可集中研究菌种的筛选、诱变、纯化、复壮、改良及保藏等技术。节省大量人力物力,并能稳定提高工厂生产水平。改革并改进发酵设备、提取设备和提取工艺研究采用大型的无搅拌发酵罐,改进空气净化系统和发酵灭菌消毒工艺。采用石灰为中和剂代替碳酸钙。改进中和罐、酸解罐的结构与形式。实现、“电导”传感器控制中和及酸解终点,实现自动流加、温控,提高改进酸解液浓度及酸解工艺。采用阴离子与阳离子净化,控制工艺用水质量。采用二效三体浓缩及结晶,连续离心结晶。实现密闭连续化、自动化生产。提高产品质量及整个柠檬酸工业生产水平。开展柠檬酸系列产品的开发与研究。改进柠檬酸钠、钾、垵生产工艺。要从发酵液中直接提取这些盐类。此外,对柠檬酸醋如柠檬酸三丁醋虽有研究,具有广阔的前景,但尚未工业化生产,还有柠檬酸本身的品种也需扩大,除生产一水及无水柠檬酸外还应生产液体柠檬酸,工业用柠檬酸等等。供短途客户或使用方便之需要,可节省大量人力与物力。生产方法提取：植物原料中提取发酵法：进行柠檬酸发酵制得发酵生产原料碳源：各种含淀粉的原料。国外生产柠檬酸主要碳源为糖蜜，糖蜜原料成分复杂、多变，使用前须进行处理，如加活性炭、黄血盐、石灰、磷酸钙等。我国以甘薯干粉用得最多，发酵使用浓度由原先的12％~16％提高至17％~22％，相应的产酸水平也由原来的6％~9％提高到10％~14％。为了解决高浓度的薯干粉给发酵及后处理带来的麻烦，用纯淀粉替代薯干粉或加适量的α淀粉酶进行液化是十分必要的。利用C9~C23的烷烃为原料时，需选择合适的菌株并要解决溶解性问题。氮源：薯干粉不需要氮源。以淀粉等不含氮源时需加入适量氮源为0.3％~0.4％。微量元素：Cu、Mn、Mg等为所需的微量元素，但过量则将造成毒害。生产菌种工业生产几乎都是用黑曲霉作为生产菌大多数微生物在代谢过程中都能合成柠檬酸，正常生理状况下很少积累柠檬酸。黑曲霉产酸量高，转化率也高。且能利用多种碳源，因而是柠檬酸生产的最好菌种。用石油副产品为原料生产柠檬酸，主要以假丝酵母属为生产菌种，其次是毕赤酵母、球拟酵母、汉逊氏酵母和红酵母属的一些种。柠檬酸合成途径与代谢调控1940年，Krebs:TCA；1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途径所有酶；1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢；1954-1955年，Ramakrishman等发现黑曲霉中存在TCA循环。一、柠檬酸合成途径的发现二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。(3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制1、磷酸果糖激酶（PFK）：（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响

Mn2+缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？

当培养基中Mn2+缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰CoA（二）三羧酸循环的调节1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：

顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。

顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。

3、α-酮戊二酸脱氢酶的调节

在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是，α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：①TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。②α-酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。(三)氧对柠檬酸积累的调节乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：(1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。

当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。

（四）乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸乙醇乙酸3醋酸1柠檬酸生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸酵母N源耗尽后开始烷烃发酵，低浓度AMP抑制NAD-异柠檬酸脱氢酶的活性，柠檬酸大量合成并积累。此时顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸=90：7：3。细胞质中积累大量异柠檬酸。①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，有一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链：解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通。

②丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。小结：

③顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。

④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。（五）柠檬酸发酵的产率1、无CO2固定反应的产率合成1分子柠檬酸需要3分子乙酰辅酶A，也就是需要1.5分子的葡萄糖。理论产率为：192/(180×1.5)=

71.1%2、通过CO2固定反应提供C4二羧酸四、柠檬酸发酵过程的控制要点（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，使EMP畅通无阻。（3）控制培养基中的Fe2+的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。（2）

控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：

1.透明圈大的菌株

平板：10%甘薯+2%的琼脂+0.5%CaCO3

诱变后，涂布，透明圈大的则好

2.显色圈大小

平板：麦汁培养基+pH值指示剂

诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好。

3.不分解柠檬酸的菌株

不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其TCA循环中柠檬酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。

方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。

4.选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株

在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。（为何？中间产物少，C架少，不利于合成代谢……）柠檬酸的静置浅盘发酵表面发酵主要原料为糖蜜发酵容器：不锈钢耐腐蚀的金属盘培养液：12%-20%的糖蜜，添加黄血盐、EDTA等，以干孢子喷雾接种。培养盘固定在培养室内，培养室具有灭菌保温和无菌空气供给系统。发酵温度：30℃发酵过程：通入无菌空气，孢子1-2天发芽，然后长成菌盖，发酵周期一般为6-8天，pH降至2.0，柠檬酸产量200g/L-250g/L，每百克葡萄糖约生成75g左右的柠檬酸，柠檬酸合成高峰时为0.9kg/m3h-1.1kg/m3h，平均合成速率0.2-0.4kg/m3h。柠檬酸的分离提取分离方法：钙盐法、直接提取法、溶媒萃取法、离子交换法和渗析法等柠檬酸钙的生成发酵结束后滤去菌丝，滤液按总酸量的70%加入碳酸钙粉进行中和，随后煮沸柠檬酸钙沉淀出来，在95℃以上高温时柠檬酸钙溶解度低，而其他有机酸的钙盐溶解度高，热水洗涤干净。硫酸置换反应将洗净的柠檬酸加水搅成糊状，在搅拌下加入浓硫酸，温度80℃以上，硫酸与钙离子形成硫酸钙沉淀下来，将柠檬酸置换出来。硫酸的用量约为加入碳酸钙的85%-90%，如果加入的量不足，余下的柠檬酸三钙混于柠檬酸中，柠檬酸无法结晶；过量的话会引起柠檬酸分解，产品颜色深。严格控制温度。脱色：得到纯净的晶体，首先须除去色素，活性炭脱色和打孔树脂脱色。去除阳离子杂质：树脂进行离子交换，当有pH的溶液流出时，表示已有柠檬酸流出，开始收集。浓缩：减压浓缩结晶：缓慢搅拌钙盐法缺陷钙盐法因为工艺成熟、设备简单、原材料易得和产品质量稳定等特点而在国内外被广泛使用。但也存在缺陷:一是得到的提取液中柠檬酸质量分数较低;二是单元操作损失多,总收率低;三是在提取过程中柠檬酸经历了多次相变,消耗化工原料多,固液分离量大,能耗高;四是环境污染严重,产生大量的固体废弃物CaSO4和废水。另外还有提取工艺长、工人劳动强度大、工作环境恶劣、提取设备腐蚀严重等缺点直接提取法：适用柠檬酸含量高杂质少的发酵滤。过滤清液先用活性炭脱色去除杂质，浓缩结晶。用CFCl2-CFCl2抽提蛋白质及其他杂质，将滤液分离浓缩结晶。以甲醇沉淀蛋白质，洗涤沉淀回收沉淀后浓缩结晶。活性炭将滤液脱色、浓缩再用3倍丙酮沉淀蛋白质分离回收丙酮然后再浓缩结晶。萃取法：用溶媒将柠檬酸从发酵滤液中分离出来。1.含碳氢氧的乙酸乙酯二乙醚甲基异丁酮2.含磷氧键的磷酸三丁脂3.含硫氧键的亚砜4.有机胺红薯制备柠檬酸的方法

我国在1968年获得了薯干原料深层发酵柠檬酸成功。薯干原料深层发酵生产柠檬酸，原料丰富矿工艺简单，发酵水平较高，在很多地方都有生产柠檬酸的工厂。工艺流程培菌——糊化发酵——中和——酸解——浓缩结晶工艺操作要点：培菌菌种为黑曲霉。黑曲霉不但能利用淀粉,而且还对蛋白质、纤维素、果胶物质等均有一定分解能力，它的产酸能力也较高，在生产上比应用其它微生物有更多优点。培菌的过程也是用试管、三角瓶、种母罐等逐步扩大培养。培养究竟分几个阶段可由生产规模来决定。按照酒精生产中所介绍的方法，用米曲汁或麦芽汁，再在其中加2%的琼脂配成培养基，分盛于试管中，每管5～10毫升，经灭菌处理后，斜置使其成斜面。将在土壤中分离的或生产中留用的合格菌种，用无菌操作接入试管培养基中。在32～34摄氏度的温度下培养5～6天，待繁殖旺盛，检验合格后，用无菌水将孢子完全洗下，即为孢子悬浮液。生产上所用的种母醪是在种母罐串培养的。培养基中的糊化醪与发酵所用的糊化醪相同。将浓度为12%～14%的红薯淀粉浆液，放在灭过菌的种母罐中，通入1千克/平方厘米的蒸汽蒸煮糊化15～20分钟，待冷至33摄氏度，接入合格的孢子悬浮液，保持32～34摄氏度的温度，通入无菌空气，并用搅拌机搅拌进行发酵。每12小时取样检查，经5—6天即可发酵完全。检验合格后，即可投入发酵罐中使用。工艺操作要点:糊化发酵红薯干经粉碎过筛后，送入拌料桶，加水配成浓度为12%～14%的淀粉浆液，用输送泵打入发酵罐，通入1千克/平方厘米的蒸汽蒸煮糊化15～20分钟。将糊化醪冷至33摄氏度时，按接种量为5%～7%接入种母罐中培养好的种母醪，在32～34摄氏度温度下搅拌，通入无菌空气发酵，每隔一定时间取样检查，发酵过程中控制pH为2.5～3，经5～6天即可完成发酵。在柠檬酸发酵过程中，pH值的控制对产酸关系很大。因为用薯干粉发酵生产柠檬酸时，首先要利用黑曲霉的糖化酶将淀粉先转化成葡萄糖，然后由葡萄糖转变成柠檬酸。糖化的最适pH值约为2.5～3.0，生成柠檬酸的pH值在2.0～2.5，如果发酵初期产酸过猛，就会影响糖化不彻底，造成残糖量高，产酸量低；或发酵过程中始终处于高pH值状态，就会生成以草酸为主的杂酸。解决这一问题一般可采用二种方法：一是调节通气和搅拌的强度，如前期通风量低些对糖化有利，后期适当增加风量，能促进产酸。二是在pH值降至2.0左右；加入一定量的灭菌碳酸钙乳剂，使pH值回升至2.2左右时，有利于糖化作用，能继续积累柠檬酸。工艺操作要点：中和发酵后的物料，生产上叫发酵醪。发酵醪出料后，真空抽滤即为含柠檬酸的发酵液。先将发酵液用泵打入中和桶，加热到60摄氏度左右，再加入碳酸钙粉末或石灰乳。碳酸钙用量可按下式计算：碳酸钙用量=柠檬酸总量*0.714