免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用概要课件

提纲磁性微球磁性微球结构、分类及特点磁性微球的制备磁性微球分离技术免疫磁株免疫磁珠结构与性质免疫磁株的特点免疫磁珠的分类免疫磁珠的制备免疫磁珠分离技术免疫磁珠技术的应用免疫磁珠在食品安全检测中的应用免疫磁珠与其它检测手段的联用免疫磁珠技术在其他领域的应用免疫磁珠技术的优缺点及发展望一磁性微球是通过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的复合微球。高分子磁性微球表面具有众多表面功能基团，同时具有磁响应性，在外加磁场作用下具有磁导向功能。目前已广泛用于生物医学、细胞学和分离工程等领域。二磁性微球结构、分类及特点磁性核材料多为Fe、Co、Pt、Ni等金属及其氧化物。如Fe3O4、γ-Fe2O3、MeFe2O3（Me=Co、Mn、Ni）、BaFe12O19、铁钴合金（Fe-Co和Ni-Fe）。最常用的是Fe、Fe2O3、Fe3O4。其中Fe3O4应用最多。构成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物质。天然高分子有明胶、球蛋白、牛血清白蛋白、聚赖氨酸、淀粉和多种聚糖如纤维素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖、果胶等。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺类、聚苯胺及硅烷等。这些材料可单独用，也可复合使用。磁性微球表面可根据需要赋予不同的功能基团(如－OH、－COOH、－CHO、－NH2,—SH、—CONO2、—CONH2、—SO3H、—SiH3、—环氧基、—CHCl等)，使其表现具有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不同物理性质。同时具有磁响应性，在外磁场作用下具有磁导向性。导电聚合磁微球聚合磁微球对磁性微球的要求：粒径均匀、大小合适、比表面积大、吸附力强、具有强的超顺磁性、悬浮均匀稳定性好、不易聚集沉淀、表面具有多种活性基团、理化性质稳定、具有较好生物相容性、对细胞、机体、活性物质损伤小。由于环氧基、氯甲基功能基团非常活跃，不需连接其他活性基团即可与生物配基（如抗体、抗原等）偶联，及其他基团的微型磁珠在生物学、医学方面应用较为广泛。三磁性微球的制备

磁性微球制备方法：共沉淀法、悬浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及原子转移自由基聚合法等。1.共沉淀法

金属离子在碱性条件下与高分子共沉淀，一步反应生成磁性高分子微球的方法。2Fe3++Fe2++8OH→Fe3O4+4H2OPich[等先通过单体聚合反应得到PS-AAEM颗粒分散剂，再把配制好的Fe3+、Fe2+溶液加入聚苯乙烯（PS）-乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯（AAEM）颗粒的分散剂中，然后滴加NH3·H2O。Fe3O4粒子在PS-AAEM表面沉积，制得PS-AAEM为核心、Fe3O4粒子为壳层的磁性微球。微球的磁性能通过改变FeCl2和FeCl3的浓度或改变PS-AAEM核心的尺寸来控制。Xia等把一定配比的FeCl2、FeCl3与葡聚糖（dextranT-10）共混，然后滴加NH3·H2O，在超声连续作用下水浴加热，制得以Fe3O4为核、dextran为壳的磁性微球。杨玉东等把一定配比的FeCl3·6H2O、FeCl2·6H2O与配体（如二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）或乙二氨四乙酸（EDTA）等）组成的混合液体加入到75℃的葡聚糖T-10溶液中，并快速滴加NH3·H2O，制备了葡聚糖为壳、氧化铁为核的磁性微球。吸取上清液:取1支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深人液面，轻轻吸走上清液。是通过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的复合微球。具有均匀性、超顺磁性及保护性外壳，由磁性载体微球和免疫配基结合而成，表面具有专一亲和性和吸附作用。方法简便，可用于土壤中细菌芽孢DNA的提取，不能彻底除去PCR抑制剂。除在菌落周围有一环外.2anti-Fab抗体法：用anti-Fab抗体与磁珠偶联抗体竞争目的细胞，是磁珠与目的细胞解离，用磁场除去游离磁珠，即可获得非标记细胞。ComparationofseveralDNAextractionmethodsIMB技术在医学领域有广阔应用前景，它可以检测肿瘤细胞，如骨髓中肿瘤细胞的检测、淋巴结中肿瘤细胞的检测。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺类、聚苯胺及硅烷等。Datta等利用副溶血性弧菌ATCC17802制备针对极鞭毛的单克隆抗体,这将有益于快速检测从环境来源的副溶血性弧菌。几种DNA分离方法的比较吸取50μL免疫磁珠悬液.每个样品更换1支加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。十二免疫磁珠在食品安全检测中的应用结果用该方法对甘草药材和中成药中甘草蛋白抗原检测，检测灵敏度10ng／mL。制备方法：先制备磁性微球，然后将磁性微球分散于抗体配机溶液中使磁珠与抗体充分吸附结合，然后分离免疫磁珠分散于缓冲溶液中可以使用。在CT-SMAC平板上，典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色;发酵山梨醇的菌落为红色;在改CHROMagar

O157弧菌显色琼脂平板上为圆形、较小的菌落，中心呈淡紫色一紫红色，边缘无色或浅灰色。结果用此磁珠分离后，只有金黄葡萄球菌的浓度有明显的降低。当目的细胞含量特别低，无法直接进行阳性分选时，可采用阴性分选发先出去其他杂细胞，当目的细胞富集到一定程度时在采用阳性分选发筛选目的细胞。利用IMB可有效地吸附、浓缩大量样品中的少量病原微生物,IMB为难于从环境及食品中分离病原性副溶血性弧菌的问题提供一种有效手段。2聚合法制备磁性微球过程异相聚合法包括分散聚合、乳液聚合、悬浮液聚合三种。该法是将磁性粒子用表面改性剂、偶联剂、引发剂等处理后分散到含有聚合物单体的溶剂中进行聚合反应。通常以磁性粒子为活性中心进行单体聚合。四磁性微球分离技术MACS(MagneticActivatedCellSorting)

是将免疫学+细胞生物学+磁力学结合为一体，利用磁性微球表面功能基团的专一亲和特性或多孔吸附特性吸附特定组分，然后用外力磁场作用将吸附了特定物质的磁珠加以分离，再经过洗脱磁珠上吸附的目标物质的一种新型分离技术，具有广泛的用途。

几种DNA

分离方法的比较ComparationofseveralDNAextractionmethods方法

传统法鳌合树脂法玻璃粉法磁珠法免疫亲和法DNA提取酚/氯仿等溶剂抽提Chelex100树脂吸附玻璃粉吸附离心分离磁珠吸附磁场分离抗原抗体反应磁场分离适用范围大多数标本DNA提取纯化培养及各种临床标本土壤标本冰冻、陈旧组织冰冻、陈旧组织，样本含量很少的标本方法评价DNA纯度高、含量多，但较费时，步骤繁琐，用有机溶剂，有损操作者健康。可用于培养标本和各种临床标本细菌及部分病毒核酸的提取。方法简便，可用于土壤中细菌芽孢DNA的提取，不能彻底除去PCR抑制剂。简单、快速，整个过程不到2h，可获得较纯DNA。适于少量样本。DNA纯度高，含量多，适于样本含量少标本，单克隆抗体的制备是关键。五免疫磁珠免疫磁珠（IMB）也称免疫磁性微球，是在磁性微球表面偶联上免疫配基的一种磁性微球，是将磁性微球技术和免疫学相结合的特殊磁性微球。六免疫磁珠的结构与性质免疫磁珠核心为顺磁性粒子，核心外层包裹一层高分子材料，最外层是免疫配基。免疫配基

免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到磁性载体微球上形成免疫磁珠。由于载体微球制备材料和方法不同，其表现出的物理性质也不同，从而可结合不同的免疫配基，如抗原、抗体、凝集素、DNA和RNA等。配基必须具有生物专一性的特点，而且载体微球与配基结合要不影响或改变配基原有的生物学特性，保证磁珠的特殊识别功能。免疫磁珠的性质具有均匀性、超顺磁性及保护性外壳，由磁性载体微球和免疫配基结合而成，表面具有专一亲和性和吸附作用。免疫磁珠大小和形状具有均一性，可使靶物质迅速有效地结合到磁珠上，可使新生成复合物在磁场中具有相同磁响应性，且行为一致。磁珠球形结构可消除与不规则形状粒子间的非特异性结合，顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性，并做定向移动，从磁场移出时磁性消除，磁珠分散，可方便地进行分离和磁性导向。保护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀；免疫配基可专一性结合反应体系中相应的抗原、抗体、核酸等生物活性物质。七免疫磁株的特点磁性微球与免疫配基结合牢固。不影响或改变免疫配基原有的生物特性和特异性。免疫微球的识别专一性。在磁场中具有顺磁性，离开磁场磁性消失，易于分散。

由于聚苯乙烯磁性微球强度高、表面易进行化学维修饰，是比较理性的制造免疫磁珠的材料。八免疫磁珠的分类

根据磁珠在磁场中受力大小及磁珠体积，分为小磁珠和大磁珠。大磁珠：1-5um，粒径较大、悬浮稳定性差、易沉淀、比表面积小、吸附能力低、吸附活性配基少、对细胞影响大，特别是阳性分选时需将磁珠与细胞解离后方可进行下一步实验。但磁力强，无需特殊分离柱即可实现样品分离，分离速度快、过程简单、成本低。小磁珠：50nm以下，粒径较小、悬浮稳定、比表面积大、表面吸附活性配基多，只有细胞体积的万分之一，对细胞表型和功能影响小，不影响细胞的后续培养。但磁力弱，需特殊分离柱才能实现样品分离，分离速度慢，成本高九免疫磁珠的制备免疫磁珠的制备是将磁性微球和抗体等配基结合而成。磁性微球与抗体的连接方式有共价结合和吸附结合两种方式。共价结合：依靠磁珠表面的活性基团如-CHO、-COOH等与抗体Fab段上的-NH2共价反应和结合吸附结合：依靠磁珠巨大的比表面与抗体见得非特异性吸附而结合。共价结合的牢固度远远大于吸附结合牢固度。制备方法：先制备磁性微球，然后将磁性微球分散于抗体配机溶液中使磁珠与抗体充分吸附结合，然后分离免疫磁珠分散于缓冲溶液中可以使用。十免疫磁珠分离技术免疫磁珠(immunomagneticbead,IMB)分离技术：是一种以特异的抗原抗体反应为基础的免疫学磁性微球检测和分离技术。它是以抗体包被的微球磁珠为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原—抗体复合物，此复合物在外加磁场作用下发生定向移动，从而达到分离抗原的目的。

基本原理：磁性微球经过一定处理后,将抗体结合到磁珠上,形成免疫磁性微球（标记磁珠）,标记磁珠的抗体与特异性抗原结合形成抗原—微球复合物,该复合物在磁场中具有与其它组分不同的磁响应性,在磁力作用下,该复合物发生力学移动,从而达到分离抗原的目的。以细胞分离为例图解免疫磁珠技术的原理免疫磁珠标记方法1直接磁珠和直接标记法通过物理吸附和共价键结合直接将特意性抗体与磁珠耦合，然后再与相应细胞结合，形成细胞-抗原-抗体-磁珠复合物，在外磁场下直接分离目的细胞。快速、简单、特异性和细胞得率高，灵敏度低，需制备相应的偶联抗体磁珠。2简介磁珠和间接标记法使用anti-lg等与磁珠偶联，通过Anti-lg再使磁珠与二抗体偶联，分离细胞时，先使细胞与一抗特异性结合，然后在与一抗标记磁珠结合，形成细胞-1抗-2抗-anti-lg-磁珠复合体，在外磁场下分离目的细胞的方法。该法增加了细胞的洗涤步骤，特异性也会降低。该法一般用于①没有直标磁珠抗体②需用几种抗体去除多种细胞③目的细胞上特异性抗原分子表达水平低。每个样品更换1支加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。免疫磁珠与其它检测手段的联用同时还能捕获受损伤靶细菌。免疫磁珠可借助亲和素——生物素系统与非蛋白结合（如各种DNA、RNA大分子）。在磁场中具有顺磁性，离开磁场磁性消失，易于分散。方法简便，可用于土壤中细菌芽孢DNA的提取，不能彻底除去PCR抑制剂。磁性微球表面可根据需要赋予不同的功能基团(如－OH、－COOH、－CHO、－NH2,—SH、—CONO2、—CONH2、—SO3H、—SiH3、—环氧基、—CHCl等)，使其表现具有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不同物理性质。接种于TSA-YE琼脂平板，纯培养由于环氧基、氯甲基功能基团非常活跃，不需连接其他活性基团即可与生物配基（如抗体、抗原等）偶联，及其他基团的微型磁珠在生物学、医学方面应用较为广泛。且在其周围形成一个晕环。免疫磁珠技术在其他领域的应用制备方法：先制备磁性微球，然后将磁性微球分散于抗体配机溶液中使磁珠与抗体充分吸附结合，然后分离免疫磁珠分散于缓冲溶液中可以使用。coliO157∶H7，满足流行病学的研究要求和提高控制力度。2）分离

将Eppendorf管固定在磁架的管孔中。将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。在菌落中心部位的深层也形成黑点。是通过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的复合微球。李斯特氏菌在PALCAM琼脂平板上与在()XA琼脂平板上菌落相似。构成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物质。几种DNA分离方法的比较1800轻缓摆动磁架5次--6次,使免疫磁珠聚集到磁极。MACS微珠直标微珠多选微珠间标微珠免疫磁珠分选方法阳性分选：运用特异性抗体偶联磁珠直接从细胞混合物中分离目的细胞的分选方法称为positiveselection.阳性分选中磁珠标记的细胞即为目的细胞。该法简单、快速、细胞得率和纯度较高。如采用anti-CD14磁珠分选CD14+巨噬细胞。阴性分选：用抗体偶联磁珠去除无关细胞，使目的细胞得以纯化和分离的分选方法称为negativeselection.阴性分选中磁珠标记的细胞为非目的细胞。如分离CD4+T细胞时，由于没有专用的CD4+T细胞分选磁珠，可通过anti-CD8、anti-B220、anti-CD49b、anti-CD11b、anti-Ter119标记磁珠去除CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、巨噬细胞、粒细胞等，最终而获得较纯的CD4+T细胞。因此阴性分选法适用于：①从细胞混合物中去除某种类型细胞。如肿瘤细胞。②缺乏针对目的细胞筛选的特异性抗体磁珠时。③抗体和目的细胞结合可能诱导细胞活化，影响后续细胞功能分析时。复合分选：将阴性分选和阳性分选相结合的分选方法。当目的细胞含量特别低，无法直接进行阳性分选时，可采用阴性分选发先出去其他杂细胞，当目的细胞富集到一定程度时在采用阳性分选发筛选目的细胞。免疫磁珠与细胞解离1过夜培养法：常用方法。将结合磁珠细胞置于10%胎牛血清培养基中37℃5%CO2细胞培养箱中培养16-24h，磁珠可从细胞上脱落，再通过磁场除去游离磁珠，即可获得裸细胞。2anti-Fab抗体法：用anti-Fab抗体与磁珠偶联抗体竞争目的细胞，是磁珠与目的细胞解离，用磁场除去游离磁珠，即可获得非标记细胞。3酶解法：通过木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶使磁珠与细胞解离，再通过磁场除去游离磁珠，获得裸细胞。免疫磁珠分离装置

免疫磁珠分离装置由超强磁铁分离器和分离柱组成。磁铁和分离柱的型号多样，配合0.5ml、1.5ml微量离心管，15ml及50ml离心管或试管，和96孔或384孔培养板中样品的分离，以满足不同试验要求。十一免疫磁珠分离技术的应用分离抗原抗体分离蛋白和多肽分离多糖物质分离DNA和RNA分离细胞和病毒靶向释药系统的载运食品有害微生物分析与检测磁珠法分离抗体、抗原、蛋白、多肽、多糖、DNA、RNA操作过程示意图每个样品换用1支无菌加长吸管。35℃士1℃培养22h-48h。1直接磁珠和直接标记法吸取50μL免疫磁珠悬液.金属离子在碱性条件下与高分子共沉淀，一步反应生成磁性高分子微球的方法。结果用该方法对甘草药材和中成药中甘草蛋白抗原检测，检测灵敏度10ng／mL。报告加20μL准备好的免疫磁珠。以细胞分离为例图解免疫磁珠技术的原理免疫磁珠分离装置由超强磁铁分离器和分离柱组成。磁性核材料多为Fe、Co、Pt、Ni等金属及其氧化物。Notzon等用IMB-荧光PCR检测肉类中的沙门氏菌，实验包括非选择性增菌、免疫磁珠分离、DNA提取及PCR扩增，12～13h即可完成检测过程，IMB-荧光PCR在检测自然感染肉类和人工感染肉类都具有较高的敏感性和特异性。2）筛选

李斯特氏菌在CHROMagar显色培养基上菌落为蓝色.免疫磁珠可以看作是亲和层析技术中的微型配基，体，在基质上固相化抗体或抗原后，形成特异性吸附后，再进行磁性亲和抽屉不需离心过滤，用于分离和纯化相应的生物大分子。利用IMB可有效地吸附、浓缩大量样品中的少量病原微生物,IMB为难于从环境及食品中分离病原性副溶血性弧菌的问题提供一种有效手段。且在其周围形成一个晕环。简单、快速，整个过程不到2h，可获得较纯DNA。在检测时间方面可将常规检测方法中的72小时检测周期缩短至40小时，而且能有效减轻过程交叉污染;吸取上清液:取1支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深人液面，轻轻吸走上清液。1%，且50%的巨核细胞具有生物活性，分离的巨核细胞超微结构保持完整，可用于巨核细胞的分子生物学等方面研究。μMACSVitalvirusHiv分离试剂盒分离标记造血细胞表面的Hiv-1病毒CD44H异型细胞免疫磁珠标记细胞示意图免疫磁珠分离细胞及病毒示意图十二免疫磁珠在食品安全检测中的应用免疫磁珠对病毒细胞具有特异选择性，因此能用于食品有害微生物的检测。免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有检测迅速、有选择性分离目的微生物，有效减少背景干扰，提高了精准性。同时还能捕获受损伤靶细菌。目前，免疫磁珠技术已广泛用于食品样品中致病微生物的检测。大肠杆菌O157的检测传统分离E.coliO157∶H7所采用的直接分离法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、工作量大等缺点。采用免疫磁珠技术，能够快速地从各种食品样品中分离富集E.coliO157∶H7，满足流行病学的研究要求和提高控制力度。现在这种免疫磁珠的方法已经被英国公共健康服务实验室认定为标准的分离方法，我国也已将免疫磁珠法对大肠杆菌O157的检测纳入国家标准（GB/T4789.36-2008）和出入境检验检疫行业标准(SN/T1059.5-2006)。已有市售的专用免疫磁珠销售。检样25g(mL)+225mL改良EC肉汤（mEC+n），均质225mL免疫磁珠捕获涂布CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板挑取可疑菌落5个~10个，氧化酶阴性，革兰氏阴性杆菌接种TSIMUG-LST阳性GB/T4789.36-2008免疫磁珠捕获法检测O157∶H7程序阴性血清学试验非O157细菌生化试验报告↓↓↓↓↓↓↓↓36±1oC18h~24h36±1oC36±1oC18h~24h18h~24h1增菌

2免疫磁珠捕获与分离

1.将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每支Eppendo-rff管的盖子，每管加人20μLE.coli0157免疫磁珠悬液。

2.取mEC+n肉汤增菌培养物1mL，加人到Eppendorff管中，盖上盖子，然后轻微振荡10s。每个样品更换1支加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。

具体操作该法增加了细胞的洗涤步骤，特异性也会降低。其中Fe3O4应用最多。检样免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有检测迅速、有选择性分离目的微生物，有效减少背景干扰，提高了精准性。3酶解法：通过木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶使磁珠与细胞解离，再通过磁场除去游离磁珠，获得裸细胞。2Fe3++Fe2++8OH→Fe3O4+4H2O共价结合的牢固度远远大于吸附结合牢固度。现在这种免疫磁珠的方法已经被英国公共健康服务实验室认定为标准的分离方法，我国也已将免疫磁珠法对大肠杆菌O157的检测纳入国家标准（GB/T4789.吸取50μL免疫磁珠悬液.Hara-Kudo等利用IMS和显色培养基分离贝类中产TDH的副溶血性弧菌O3:K6。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺类、聚苯胺及硅烷等。IMB技术检测沙门氏菌的优点②缺乏针对目的细胞筛选的特异性抗体磁珠时。Hudson等研究表明，将免疫磁珠技术与PCR结合，24h内即可检出火腿中的单增李斯特菌。1mL转种10mLFB2増菌液（35℃，24h士1h）加20μL准备好的免疫磁珠。每个样品更换1支加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。制备方法：先制备磁性微球，然后将磁性微球分散于抗体配机溶液中使磁珠与抗体充分吸附结合，然后分离免疫磁珠分散于缓冲溶液中可以使用。除在菌落周围有一环外.通常以磁性粒子为活性中心进行单体聚合。

3.结合:在18℃~30℃环境中，将上述Eppendorff管连同磁板架放在DynalMXl样品混合器上转动或用手轻微转10min，使E.coliO157与免疫磁珠充分接触。4.捕获:将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不断地倾斜磁板架，确保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来，此时，在Eppendorff管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。

5.吸取上清液:取1支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深人液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到Eppendorff管中，并重复4步骤。每个样品换用1支无菌加长吸管。6.洗涤:洗涤免疫磁珠混合物，重复上述步骤

4~6和4~5。7.免疫磁珠悬浮:将免疫磁珠重新悬浮在100μLPBS-Tween20洗液中。8.涂布平板:用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板一侧，再用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于36℃士10℃培养18---24h。菌落识别在CT-SMAC平板上，典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色;发酵山梨醇的菌落为红色;在改CHROMagar

O157弧菌显色琼脂平板上为圆形、较小的菌落，中心呈淡紫色一紫红色，边缘无色或浅灰色。

初步生化试验:在CT-SMAC和改良CHROMagar

O157弧菌显色琼脂平板上挑取5个~10个典型或可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，于36℃士1℃培养18

h~24

h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢(H2S)。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察，无荧光产生者为阳性结果，有荧光产生者为阴性结果;对分解乳糖且无荧光的菌株，在营养琼脂平板上分纯，于36℃士1℃培养18

h~24

h，并进行鉴定。Fratamico等将兔抗E.coliO157∶H7多克隆抗体连接到羊抗兔IgG包被的磁珠上，从食物增菌培养液中分离O157∶H7菌株，再将带菌的磁珠接种到培养基上，加入荧光素标记的O157∶H7抗血清，在荧光显微镜下观察，此法敏感性为10cfu/mL增菌培养液。Decory等建立了免疫磁珠-免疫脂质体（IMB/IL）荧光试验方法，可在8h内快速检测出多种液态样品（水样、苹果汁、苹果酒）中低至1cfu/mL的E.coliO157∶H7，而传统微生物学方法不能从阴性样本中区分出E.coliO157∶H7感染样本。单核细胞增生李斯特菌的检测

传统的单增李斯特菌检测方法检测周期长，约5～14d，步骤繁琐且灵敏度低，而IMB技术的优点在于在较低的菌液浓度时也可以通过免疫磁珠的富集作用进行检测，缩短了检测时间并进一步降低了单增李斯特菌的检测限。

2008年，我国将免疫磁珠检测单核细胞增生李斯特菌的方法纳入了出入境检验检疫行业标准中(SN/T0184.3-2008)。检样25g(mL)对225mLFB1増菌液（30℃士1℃，24h士1h）1mL转种10mLFB2増菌液（35℃，24h士1h）通过免疫磁珠捕获李斯特菌，然后再用灭菌缓冲液洗涤用0.1mL的灭菌缓冲液重新制成悬液吸取50uL免疫磁珠悬液划线于CHROMagar显色培养基，OXA/PALCAM琼脂平板（35℃+1℃,24h~28h)各挑选5个典型菌落接种于TSA-YE琼脂平板，纯培养鉴定和确认试验单增李斯特菌的检测程序与方法1样品制备2增菌3免疫磁珠分离((IMS）1)免疫捕获

混增菌培养液.沉淀所有的粗糙食物残渣.从增菌培养液中移取1mL上层液体(要尽可能避免移取到食物颗粒和脂肪颗粒)加人Eppendorf管中.加20μL准备好的免疫磁珠。在旋涡混合器上混合该悬液。2）分离

将Eppendorf管固定在磁架的管孔中。1800轻缓摆动磁架5次--6次,使免疫磁珠聚集到磁极。小心地打开磁架上的Eppendorf管管盖,从磁极对面一侧慢慢吸出液体，注意不要接触管壁上的磁珠。每一个样品换一次枪头;加1

mI灭菌的PBS

，并重新盖好盖子.将磁极从支架上移走，1800轻缓摆动磁架5次一6次,使管内各成分混合,后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几次。将离心管从磁性分离器上移开.并加100μL灭菌的PBS到管中，重悬磁珠。如实验室没有磁性分离器，可以用手摇代替.

4.分离培养1）分离培养吸取50μL免疫磁珠悬液.加到显色培养基及任一选择性培养基OXA、PALCAM琼脂平板上.用无菌接种环划线.35℃士1℃培养22h-48h。

2）筛选

李斯特氏菌在CHROMagar显色培养基上菌落为蓝色.且在其周围形成一个晕环。李斯特氏菌在OXA琼脂平板上生长22

h后菌落呈现黑色.直径为1mm.在其周围形成一个黑色环。培养48h，菌落仍呈黑色.直径2mm

--3mm.除在菌落周围有一环外.在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在PALCAM琼脂平板上与在()XA琼脂平板上菌落相似。在CHROMagar显色培养基及OXA或PALCAM琼脂平板上挑取5个或更多可疑菌落.接种于TSA-YE琼脂平板上.纯培养后进鉴定。

5.鉴定和确认Skjerve等通过包被单克隆抗体的磁珠从不同食物样品中分离李斯特菌，采用将磁珠接种到琼脂平板培养的方法进行菌株鉴定，此法的敏感性为102～104cfu/mL样品。Hudson等研究表明，将免疫磁珠技术与PCR结合，24h内即可检出火腿中的单增李斯特菌。沙门氏菌的检测Notzon等用IMB-荧光PCR检测肉类中的沙门氏菌，实验包括非选择性增菌、免疫磁珠分离、DNA提取及PCR扩增，12～13h即可完成检测过程，IMB-荧光PCR在检测自然感染肉类和人工感染肉类都具有较高的敏感性和特异性。Blackburn等将用生物素标记的抗沙门菌多价多克隆抗体连接到链霉亲和素包被的磁珠上，以此试剂检测从不同食物中提取的活沙门菌。此法的敏感性可达105cfu/g食物，总的检测时间从5d减少至1~2d。复合分选：将阴性分选和阳性分选相结合的分选方法。2聚合法制备磁性微球过程以细胞分离为例图解免疫磁珠技术的原理1%，且50%的巨核细胞具有生物活性，分离的巨核细胞超微结构保持完整，可用于巨核细胞的分子生物学等方面研究。当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。35℃士1℃培养22h-48h。IMB技术检测沙门氏菌的优点捕获:将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。先将PCR双链产物与生物素化的磁珠混合使两者结合，然后进行碱性变性处理，使PCR双股DNA成为单股DNA，可直接快速用于检测PCR样品中DNA或RNA分子并可进行测序。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺类、聚苯胺及硅烷等。从增菌培养液中移取1mL上层液体(要尽可能避免移取到食物颗粒和脂肪颗粒)加人Eppendorf管中.将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。捕获:将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。通过免疫磁珠捕获李斯特菌，然后再用灭菌缓冲液洗涤免疫磁珠分离细胞及病毒示意图此法的敏感性可达105cfu/g食物，总的检测时间从5d减少至1~2d。简单、快速，整个过程不到2h，可获得较纯DNA。Blackburn等将用生物素标记的抗沙门菌多价多克隆抗体连接到链霉亲和素包被的磁珠上，以此试剂检测从不同食物中提取的活沙门菌。检样免疫磁珠可以看作是亲和层析技术中的微型配基，体，在基质上固相化抗体或抗原后，形成特异性吸附后，再进行磁性亲和抽屉不需离心过滤，用于分离和纯化相应的生物大分子。IMB技术检测沙门氏菌的优点适用于各类食品基质中的沙门氏菌的快速检测，能快速有效富集食品基质中的目标病原菌，且有良好的灵敏度和特异性，检测限可达到1—10cfu/25g;在检测时间方面可将常规检测方法中的72小时检测周期缩短至40小时，而且能有效减轻过程交叉污染;筛选结果既可以与常规的细菌生化和血清学联用，也可以和显色培养基、荧光PCR以及微生物全自动鉴定仪器等方法联用，为食源性致病菌检测和鉴定提供有效快速筛选技术。金黄色葡萄球菌的检测陈伶俐等将人IgG结合到磁珠上，用该磁珠对样品中的金黄色葡萄球菌进行快速分离检验。取适量免疫磁珠，加入金黄葡萄球菌菌液中，磁场下分离磁珠，将分离前后的菌液及磁珠涂平板，并用大肠杆菌、白葡萄球菌等作对照。结果用此磁珠分离后，只有金黄葡萄球菌的浓度有明显的降低。对磁珠所涂平板的菌落进行鉴定，证明为金黄葡萄球菌。应用此法分离检验此菌，富集速度快，灵敏度高，效果好。刘琳琳利用自制的金属螯合免疫磁珠来检测食品中金黄色葡萄球菌，该法能够在30min内富集检测金黄色葡萄球菌且检测低限可达100CFU，同时磁珠可保持活性达3周以上。副溶血性弧菌的检测Hara-Kudo等利用IMS和显色培养基分离贝类中产TDH的副溶血性弧菌O3:K6。Datta等利用副溶血性弧菌ATCC17802制备针对极鞭毛的单克隆抗体,这将有益于快速检测从环境来源的副溶血性弧菌。张凡非等利用IMS分离环境及食品中产生TDH副溶血性弧菌，分别从1份海水、1份海泥和3份蛤肉中检出了神奈川现象阳性,并产生耐热溶血毒素的副溶血性弧菌,血清型为03:K6。IMB技术检测副溶血性弧菌的优点该方法与一般的细菌培养分离法相比,极大地提高了环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率。利用IMB可有效地吸附、浓缩大量样品中的少量病原微生物,IMB为难于从环境及食品中分离病原性副溶血性弧菌的问题提供一种有效手段。其他致病菌的检测志贺氏菌例：Islam等应用O抗原特异性单克隆抗体包被免疫磁珠，快速检测粪便中的疾痢志贺菌和福氏志贺菌。分离出的志贺菌株用PCR扩增方法进行鉴定。此种免疫磁珠分离与PCR联合法检测志贺菌，较传统的培养法敏感、快速(7h)。小肠结肠炎耶尔森氏菌例：Kapperud等用抗小肠结肠炎耶尔森氏菌血清抗体包被磁性微球，从食物和水样中分离，并能将小肠结肠炎耶尔森氏菌与假结核耶尔森氏菌和非致病性耶尔森氏菌区别开来。十三免疫磁珠与其它检测手段的联用免疫磁珠与PCR的联用

由于PCR技术灵敏度较低，将免疫磁珠技术和PCR技术相结合，建立了新的检测系统——磁免疫PCR技术。例如：它以李斯特氏菌单抗包被磁珠，对样品进行前处理，将菌进行富集裂解，再以iap基因的保守区域设计引物进行PCR，结果显示该方法具有良好特异性，而且十分灵敏。免疫磁珠与ELISA的联用

利用磁性微球，并以兔抗甘草蛋白IgG抗体致敏，制备特异性捕获甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生物素标记抗体为示踪抗体，结合辣根过氧化物酶标亲和素建立ELISA检测系统，用于甘草药材和含甘草中成药中甘草蛋白的分析。结果用该方法对甘草药材和中成药中甘草蛋白抗原检测，检测灵敏度10ng／mL。免疫磁性捕获ELISA检测技术方便、快速、准确，为生药的品种鉴定及中成药的质量控制提供一种新方法。免疫磁珠与发光检测技术联用

将磁珠技术与免疫荧光、放射免疫、发光免疫等相结合，可提高分析检测的准确性和灵敏度。

免疫磁珠荧光微球十四免疫磁珠（IMB）技术在其他领域中的应用免疫检测IMB技术在医学领域有广阔应用前景，它可以检测肿瘤细胞，如骨髓中肿瘤细胞的检测、淋巴结中肿瘤细胞的检测。另外这种技术还可以对肿瘤进行磁导向治疗和免疫磁性净化治疗。细胞分离细胞分离是免疫磁珠目前最主要应用的一个方面，传统细胞分离技术有的比较费时，有的十分昂贵，由于免疫磁珠技术分离细胞时只需要抗体和磁铁，既简便灵敏又经济快捷。如马东初用GPⅡb/Шa血小板单克隆抗体结合磁珠分离人骨中的巨核细胞，其纯度达到87.5%到97.1%，且50%的巨核细胞具有生物活性，分离的巨核细胞超微结构保持完整，可用于巨核细胞的分子生物学等方面研究。生物大分子纯化

免疫磁珠可以看作是亲和层析技术中的微型配基，体，在基质上固相化抗体或抗原后，形成特异性吸附后，再进行磁性亲和抽屉不需离心过滤，用于分离和纯化相应的生物大分子。为提纯受体分子、DNA、RNA、DNA结合蛋白及mRNA等提供希望。分子生物学的应用免疫磁珠可借助亲和素——生物素系统与非蛋白结合（如各种DNA、RNA大分子）。先将PCR双链产物与生物素化的磁珠混合使两者结合，然后进行碱性变性处理，使PCR双股DNA成为单股DNA，可直接快速用于检测PCR样品中DNA或RNA分子并可进行测序。十五免疫磁珠技术展望优点:分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单，不需昂贵仪器设备,不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等,从而在微生物检测方面具有很大的优势。缺点：免疫磁珠敏感性不高，易于其他杂菌交叉反应，价格昂贵，应用受到一定限制。IMB发展的几个方向高敏感性磁珠的制造技术降低磁珠生产成本免疫磁珠与其它检测手段联用技术免疫磁珠技术应用技术总的来说，免疫磁珠分离技术未来将在生物医学、食品、农业科研、新药开发等领域具有更加广泛的发展前景。Thankyouattention！一磁性微球是通过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的复合微球。高分子磁性微球表面具有众多表面功能基团，同时具有磁响应性，在外加磁场作用下具有磁导向功能。目前已广泛用于生物医学、细胞学和分离工程等领域。四磁性微球分离技术MACS(MagneticActivatedCellSorting)

是将免疫学+细胞生物学+磁力学结合为一体，利用磁性微球表面功能基团的专一亲和特性或多孔吸附特性吸附特定组分，然后用外力磁场作用将吸附了特定物质的磁珠加以分离，再经过洗脱磁珠上吸附的目标物质的一种新型分离技术，具有广泛的用途。

几种DNA

分离方法的比较ComparationofseveralDNAextractionmethods方法

传统法鳌合树脂法玻璃粉法磁珠法免疫亲和法DNA提取酚/氯仿等溶剂抽提Chelex100树脂吸附玻璃粉吸附离心分离磁珠吸附磁场分离抗原抗体反应磁场分离适用范围大多数标本DNA提取纯化培养及各种临床标本土壤标本冰冻、陈旧组织冰冻、陈旧组织，样本含量很少的标本方法评价DNA纯度高、含量多，但较费时，步骤繁琐，用有机溶剂，有损操作者健康。可用于培养标本和各种临床标本细菌及部分病毒核酸的提取。方法简便，可用于土壤中细菌芽孢DNA的提取，不能彻底除去PCR抑制剂。简单、快速，整个过程不到2h，可获得较纯DNA。适于少量样本。DNA纯度高，含量多，适于样本含量少标本，单克隆抗体的制备是关键。免疫磁珠的性质具有均匀性、超顺磁性及保护性外壳，由磁性载体微球和免疫配基结合而成，表面具有专一亲和性和吸附作用。免疫磁珠大小和形状具有均一性，可使靶物质迅速有效地结合到磁珠上，可使新生成复合物在磁场中具有相同磁响应性，且行为一致。磁珠球形结构可消