内源保护酶测定方法

内源保护酶测定方法一、药品与试剂配置：磷酸缓冲液配备（PBS）母液A（PbA）:0.2mol/LNaH2PO4NaH2PO4・2H2O31.2g用蒸馏水定容至1000ml。138/156母液B（PbB）:0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4・12H2O71.62g用蒸馏水定容至1000ml。268.1/358.1酶液制取酶液提取液的配备:50mMPH7.0（PBS）PbA97.5ml+PbB152.5ml定容到1000ml酶液提取时，配制成含1%聚乙烯毗咯烷酮（PVP）的50mMPH7.0PBS（现配现用）配制方法：称取1g聚乙烯毗咯烷酮溶100ml50mMPH7.0PBS中3.丙二醛（皿0）测定TCA-TBA混合液制备：101.25g三氯乙酸（TCA）+2.5g硫代巴比妥酸（TBA） 加热溶解，冷却后定容到500ml。（注：先溶解TCA,再溶解TBA）4.过氧化物酶（POD）测定POD反应液制备：0.2MPH6.0PBS:PbA87.7ml+PbB12.3ml定容至1000ml0.2MPH6.0PBS50ml+29%H2O20.028ml+愈创木酚0.019ml（注：现配现用，冰箱保存）5.过氧化氢酶（CAD—高锰酸钾滴定法50mMPH7.0PBS同上250mMH2O2 1ml30%H202定容至100ml10%H2SO4 110ml浓硫酸定容至2000ml4mMKMnO4 1.264gKMnO4溶于2000ml水中超氧化物岐化酶（SOD）测定一氮蓝四唑（NBT）法50mMPH7.8PBS：PbA10.625ml+PbB114.375ml定容至500ml130mmol/LMet（甲硫氨酸）：1.9399gMet用50mMPH7.8PBS定容至100ml。750四mol/LNBT: 0.06133gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。100|imol/LEDTA-Na2:0.018605gEDTA-Na2用PBS定容至500ml.20四mol/L核黄素： 0.03765g用水定容至500ml，避光保存。可溶性蛋白测定0.2g考马斯亮蓝G-250,溶于100ml95%乙醇中，再加入200ml85%H3PO4,用水定容至2000ml。二、实验步骤与计算方法2.酶液制取准确称取叶片0.5g,置于研钵中，先加4ml含1%聚乙烯毗咯烷酮（PVP）的50mMPH7.0PBS,在冰浴下研磨成浆，然后再用6mlPBS（分两次，一次3ml）冲洗干净，移入离心管内，16000xg冷冻离心20min，然后取上清液保存，置于冰箱中备用。全部测定结束后量剩余酶液体积，并计算酶液总体积。3.丙二醛（诃人）测定（1） 操作步骤：在10ml离心管中，先加入4mlTCA-TBA混合液，然后加入1ml酶液，沸水浴中20min后，立即冰水浴中冷却4000xg离心10min，上清液测OD532和OD600。（用制取酶液时所用缓冲液代替酶液作为空白对照）（2） 计算方法:MDA（四molgFW-1）=（OD532-OD600）x12.903x酶液总体积（ml）/鲜重g4.过氧化物酶（POD）测定（1） 操作步骤2支试管一支加3mlPOD反应液，并以制取酶液时所用缓冲液代替酶液作为空白对照八、、，另一支加3mlPOD反应液+10四1酶液混匀后OD470比色注：每隔1分钟读数一次，读6-10次，根据酶活性高低可增加或减少反应酶液量。（2） 计算方法以每分钟光密度变化值表示酶活性大小。单位Unit：^OD470g-1FW-min-1或^OD47Qmg-1pr-min-1=8D470x酶液总体积ml/称样重W/所用酶液体积5.过氧化氢酶（CAT）-高锰酸钾滴定法（1） 操作步骤在试管中加入4ml50mMPH7.0PBS，然后加入100^1酶液，再加入1ml50mMH2O2，塑料膜封口，30笆水浴保温10min，加2ml10%H2SO4终止反应，然后倒入三角瓶（或试管）中并冲洗十净，用4mMKMnO4滴定剩余H2O2，至出现粉色。 （以制取酶液时所用缓冲液代替酶液作空白对照）（2） 计算方法CAT活性=（空白滴定体积ml-样品滴定体积ml）x4x2.5x酶液总体积ml/样品重g/反应时间min/反应用酶液ml单位：H2O2四molgFW-1-min-1超氧化物岐化酶（SOD）测定一氮蓝四唑（NBT）法（1） 操作步骤在玻璃试管中，分别加入以下试剂：50mMPH7.8PBS1.5ml,130mmol/LMet（甲硫氨酸）0.3ml,750|imol/LNBT0.3ml,100四mol/LEDTA-Na20.3ml,20四mol/L核黄素0.3ml,加入酶液0.05ml,加水0.25ml。最终体积为3ml。（对照管以制取酶液时所用缓冲液代替酶液作为空白对照）做2组对照，一组置暗处，另一组与样品管一起4000lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时受光时间缩短，低时延长），反应结束以不照光对照管做空白，分别测定其它各管吸光度（OD560）（2） 计算方法SOD活性=（OD照光对照管一OD样品管）x酶液总体积x2/OD照光对照管/样品重/测定所用酶液量可溶性蛋白测定（1）测定方法玻璃试管中，加入0.1ml酶液，然后加入0.9ml水，再加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min，OD595比色。（2）标准曲线制作称取0.01g牛血清蛋白，溶于水定容至100ml，制成0.01g/100mlPr标准液。具体方法：取六支试管，按下表加入试剂，混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G—250，摇匀静置2min钟后，OD595下测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。符号123456标准蛋白质/ml00.20.40.60.81.0蒸馏水