遗传学 7. 细菌遗传（改后）

第7、8章细菌和病毒的遗传

遗传分析和基因定位

真核生物的基因定位1.Two-pointtestcross2.Threepointtestcross

Geneticmaporlinkagemap

着丝点作图(centromeremapping)—脉孢霉第一节细菌的遗传分析和基因定位

遗传学：形态--细胞水平分子水平

细菌--研究材料采用了新的生物类型特点：结构简单、周期短、不进行减数分裂，DNA裸露，易接受相同或不同物种DNA片段插入。1333um2x1um大肠杆菌的染色体结构碱基对：4639229bp预测基因数4377个研究细菌遗传的方法--平板培养Clone106

Plating一细菌的遗传分析

一个细菌DNA与另一个细菌DNA的交换重组可以通过四种方式实现：转化、接合、性导、转导1.细菌的转化与基因定位1.1转化（transformation）（1）transformation某些细菌(或其他生物)通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段，并将此外源DNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程。Avery(1944)等研究证实，转化因子是DNA

枯草杆菌大肠杆菌（2）转化的过程（1%）供体DNA与受体细胞间的接触与互作

转化片段大小:肺炎双球菌转化DNA片段至少要有

800bp，枯草杆菌最少需要16000bp

转化片段形态:转化片段必须是双链转化片段浓度：每个细胞摄取的DNA分子数受体细胞生理状态:感受态(competence)细胞能接受外源DNA分子并被转化的细菌细胞

感受态因子：促进转化作用的酶或蛋白质分子转化DNA的摄取和整合

联会

synapsis

整合

intergration结合与穿入

binding转化子重组个体A202.avi转化过程MechanismofnaturaltransformationFig.14.10BacterialtransformationFig17.5Abacterialgrowthcurve.©2003JohnWileyandSonsPublishers被转化菌株（transformant）比例：

（1）随外源DNA的浓度而升高，（2）与受体菌的生理状态有关。Transformation转化（transformation）是指受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，整合到基因组中，从而获得供体菌的部分遗传性状。供体菌与受体菌之间不需要直接接触。FragmentsofdonorDNAentertherecipientandalteritsgenotypeNaturaltransformation（自然转化）：Artificialtransformation（人工转化）：

转基因----遗传转化根癌农杆菌（Agrobacterium

tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium

rhizogenes）。转移DNA（transferredDNA，T-DNA）：T-DNA也叫三螺旋DNA，是指一种由三股ssDNA旋转螺旋成的一种特殊结构。农杆菌Ti(tumorinducing)或Ri(rootinducing)质粒中的一段DNA序列。植物细胞转化的共整合系统：T-DNA在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr。首先在E.coli中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上，Kmr筛选转化细胞。当两个基因紧密连锁时，它们就有较多的机会包括在同一个DNA片段中，并同时整合到受体染色体中。如：

trp2+

his2+tyr1+×trp2

his2tyr1↓

重组型数Trp2-his2重组值=×100%

亲型数+重组型数(3)转化和基因重组作图转化结果3660trp2his2tyr1

∣←──34─→∣←───13──∣

∣←─────40──────→∣

Trp2-his2→0.34Trp2-tyr1→0.40His2-tyr1→0.13

2.细菌的接合与基因定位作图2.1接合(conjugation)

–

菌株间杂交性别（1）接合现象的发现1946年，Lederberg和Tatum实验E.coli

K12A菌株：甲硫氨酸met-、生物素bio-

链霉素敏感

B菌株：苏氨酸thr-、亮氨酸leu-

抗链霉素黎德伯格和塔特姆的接合(杂交)试验证明大肠杆菌发生遗传重组原养型缺陷型缺陷型混合

发现长出了一些原养型的菌落转化细胞与细胞直接接触

发生的遗传物质交换和重组？

1950Davis设计了

U型管实验菌株间交配系统？在任何一臂内都没有出现原养型细菌,两个菌株间的直接接触—菌株间交配系统？Hayes（1952)试验证明，在接合过程中遗传物质的交换是一种单向的转移：

供体donor

（雄性）→性别受体

receptor

（雌性）

接合：在原核生物中，是指遗传物质从供体“雄性”转移到受体“雌性”的过程。conjugation供体--F因子（sectorfactororfertilityfactor）

94.5kb2%1--3

感染性

F纤毛蛋白4个ISDNA组成F–F+Hfr附加体Episomes

（附加体）：plasmidsthatcanintegrateintohostchromosomeFfactorReplicatesinsidehostcellFfactorcontainsgenesencodingsynthesisofpiliwhichallowcellcontact接合现象性伞毛—接合管Fpilus--conjugationtube

F+细胞的F因子由接合管向F-传递，使F–受体变成F+细胞质桥F因子及其在杂交中的行为F因子及其在杂交中的行为Hfr

（highfrequecyrecombination）Hayes的实验得到证实----分离到一种供体菌株

F–

各种不同染色体基因

重组子高（1000）为什么两个细菌细胞的接和能实现染色体上基因重组A204.aviA205.avi外基因子(exogenote)受体细胞接受的部分供体染色体内基因子(endogenote)受体完整染色体部分二倍体(部分合子\半合子)单数交换单数交换偶数交换F–F+HfrF’Partialdiploid性导(sexduction):利用F’因子将供体细胞基因导入受体形成部分二倍体的过程.接合现象性伞毛—接合管Fpilus--conjugationtube

F+细胞的F因子由接合管向F-传递，使F–受体变成F+细胞质桥中断杂交(interruptedmating)1954年F.Jacob和E.Wollman等开始进行对大肠杆菌染色体转移的动力学研究，他们发现在Hfr×F―的接合过程中，线性染色体DNA是以恒定的速率由供体向受体移动，为绘制大肠杆菌的染色体图提供了一个很有用的技术，即中断杂交(interruptedmating)。Mutantselection中断杂交试验及染色体连锁图

interruptedmatingexperiment

雅各布(Jacob，F)和沃尔曼(Wollman，E.)在五十年代设计著名实验菌株基因型：Hfr：

thr+leu+aziRtonRlac+gal+strSF–:

thr–leu–aziStonSlac–gal-strR

Interruptedmatingexperiment

37营养用来研究细菌接合过程中基因转移方式的实验基本方法：1）接合中的细菌在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌（中断杂交）；2）排除供体菌（donor：Hfr）：接种到含有链霉素（Str）的培养基上，抑制Hfr生长；同时：选择标记，最好是最早转入受体的基因。实验材料：（苏亮叠噬菌体T1乳糖半乳糖链霉素）Hfr:thr+

leu+azistonslac+gal+strsF－:thr－leu－azirtonrlac－gal－strr3）排除未接合（未重组）的受体菌（recipient：F－）以某供体基因（如thr+）作为选择标记，接种到相应的选择性培养基（如缺乏threonine）上，抑制F－菌生长4）影印到其它各种选择性培养基上，测定选择标记基因进入受体F－菌后，其它非选择性标记基因进入F―受体菌的顺序和时间。

随着时间的推移，具有某种非选择性标记基因的菌落逐渐增加，达到一定频率后处于一个稳定的水平。某基因转入的时间越早，它所达到的频率越高，“选择标记”基因与“非选择标记基因”间同时重组的频率越高，说明选择标记基因与非选择标记基因相距越近；反之，相距越远。MappinggenesinHfrandF－crossesbyinterruptedmatingexperiments接合搅拌

排除Hfr（培养基Str）Hfr:thr+

leu+azistonslac+gal+strsF－:thr－leu－azirtonrlac－gal－strr选择标记排除未接合受体菌TheinterruptedmatingexperimentofWollmanandJacob.Hfr:thr+leu+azistons

lac+gal+strsF－:thr－leu－azirtonr

lac－gal－strr中断杂交作图：根据中断杂交试验中供体基因进入受体所需时间作为基因间距离绘制连锁图的方法。图距单位为分钟。

Hfr：

thr+leu+aziRtonRlac+gal+strSF–:

thr–leu–aziStonSlac–gal-strR重组子不含苏氨酸thr+

strR链霉素str的几种不同培养基（筛）2minthr+8minleu+thr+leu+strR

selectedmarker

选择标记selectedmedium

筛选培养基含链霉素不含苏氨酸和亮氨酸Hfr：

thr+leu+aziRtonRlac+gal+strSHfr非选择标记基因进入F–所需时间

分钟从Hfr

上转移的基因909aziR

11aziR

tonR

18aziR

tonR

lac+

25aziR

tonR

lac+gal+

用不同的Hfr菌株进行中断杂交实验所作出的大肠

杆菌基因连锁图，其基因向F-细胞转移的顺序大不相同。F因子插入环状染色体的不同位置形成不同转移原点和转移方向

大肠杆菌的遗传图是环形的如转移时间小于2分钟----传统的重组作图法(recombinationmapping)例如lac+(乳糖发酵)和ade–

(腺嘌呤缺陷型)

Hfr

lac+ade+×F–lac–ade–

完全培养基不加腺嘌呤选出F–

ade+的菌落（重组子）（对测定图距没有意义，有可能ade尚未进入）Hfrlac+ade+strs

×F―

lac–ade–strr

（根据中断杂交试验，已知lac和ade紧密连锁，且lac先于ade进入F－。）基因的重组两基因间的重组频率是22%。1min约相当于20%的重组值ade转化与作图1、相邻基因发生共转化的概率与两者间的距离呈正相关：基因间距离越近，发生共转化的频率越高，反之越低。2、可以通过测定两个基因共同转化的频率来确定基因间的相对距离。F’因子与性导sexduction整合环出F´因子当发生环出时偶然不够准确，携带有染色体的一些基因，称这种F因子为F´因子。性导--sexduction接合时由F´因子所携带的外源DNA转移到细菌染色体的过程。整合在一定的座位上且整合率高。F’plasmidformationandtransferFig.14.18a,b4.转导(transduction)

Bacteriophage“Eaterofbacteria”inreality,killandlysebacterialcellssometimessimplycalled“phage”Twomajorpartsproteincoat(e.g.,head,tail)capsid(head)withDNAorRNATwodistinctphagegenotypescanbeanalyzedincrosses,allowingmappingtheviralgenomePhagecanbeusedtointroducegenesintobacterialcellsbytransductionAlsousedinrecombinantDNAtechnologyBacteriophage2．噬菌体的类型virulentphagetemperatephageTemperatephagecanintegrateintobacterialgenomethroughlysogeniccyclecreatingaprophage转导的发现：1952年，J.Lederberg和他的学生N.Zinder在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）中进行的重组实验：1.菌株：StrainLT-2：phe+trp+met-his-StrainLT-22：phe-trp-met+his+将两个沙门氏菌的营养缺陷型进行混合培养（杂交)

phe+

trp+

met-his-

StrainLT-2×

phe-

trp-

met+

his+StrainLT-22↓混合培养基本培养基↓菌落(频率为1/105)

phe+trp+met+his+conjugationtransformationDNA酶原养型重组菌在LA-22

phe+

trp+

met-

his-

LT-2

phe-

trp-

met+

his+StrainLT-22大分子和病毒通过

过滤性因子(filterableFA)↓

Why?What?FA(不受DNA酶的影响)大小和质量与P22相同

沙门氏菌的一种温和噬菌体P22穿过滤片野生型LT-22(+P22)P22少数偶然溶菌释放P22感染LT-22LT-22重组感染LT-2偶然包装LT-2基因P22P22Transduction：以噬菌体作为载体把一个细菌的遗传物质转移到另一个细菌细胞的过程，称转导.LT22菌株是携带P22噬菌体的溶源性细菌LT2菌株是对P22噬菌体敏感的非溶源性细菌；LT2DNA被裂解成小片段transducingphage再次进入LT22根据转导的特点不同，转导可分为：1）普遍性转导（generalizedtransduction）

随机转导细菌的DNA片段。0.3%

2）局限性转导（restrictedtransduction）

或称特异性转导（specializedtransduction）

指一些温和噬菌体只能转导细菌染色体基因组的某些基因，或者说只是对噬菌体在染色体基因组整合位点附近基因的转导。TransductionGeneralizedtransduction（普遍性转导）phageincorporatesrandomfragmentsofhostDNAfortransfertoanotherhoste.g.,phagesP1andP22,temperatephageswhichaccidentallystuffhostDNAintophageheadSpecializedtransduction（局限性转导）specificgenesaretransferrede.g.,phagewhichtransducesonlyadjacentgenesFrequenciesofcotransductioncanbeusedtomapgenes;inverselyproportionaltodistance

Theformationofgeneralizedtransducingvirusesandthesubsequenttransductionofrecipientbacteria流产转导GeneralizedtransductionSpecializedtransduction©2003JohnWileyandSonsPublishersRecombinationbetweenattsitesonthephageandbacterialchromosomesallowsintegrationoftheprophageFig.14.22bErrorsinprophageexcisionproduce

specializedtransducingphageAdjacentgenesareincludedincircularphageDNAthatformsafterexcisionFig.14.22cλdgal+侵染gal–菌株通过λ携带的gal+与受体基因gal–进行同源配对，经双交换，产生重组的gal+转导子，这种转导子是非溶源性的，稳定的。

λdgal+整合到受体染色体的gal–基因旁边，不稳定普遍性转导与细菌作图利用共转导频率来确定三个基因在染色体上排列顺序共转导的频率越高，表明这两个基因在染色体上的距离越近，连锁越密切；相反，两个基因的共转导频率越低，则说明两基因间距离越远。三因子转导：E.coli

trpA+supC+pyrF+

作供体，trpA–supC–pyrF–

作受体，由P1转导：trpA

代表与色氨酸（tryptophan）合成有关的基因；supC代表赭石突变抑制基因(ochre-suppressorgene)；pyrF代表与嘧啶(pyrimidine)生物合成有关的基因。最初选择supC+转导子，然后检查supC+转导子中其它两个基因被转导的情况，得到的转导类型和数目如下：

①supC+trpA+pyrF+36②supC+trpA+pyrF–114③supC+trpA–pyrF+0④supC+trpA–pyrF–

453603Differentclassesofcrossovers:quadruplecrossoverisleastfrequentFig.14.17c从最少类型的转导子③的基因型可看出：这三个基因的次序是supCtypApyrF，即typA位于中间。SupC+与trpA+共转导频率为：36+114∕603=0.25SupC+和pyrF+共转导频率为：36∕603=0.06

①supC+trpA+pyrF+36②supC+trpA+pyrF–114③supC+trpA–pyrF+0④supC+trpA–pyrF–

453603

应用中断杂交技术、重组作图、转化和转导相结合的方法已经得到细菌的非常详细的染色体图

RecombinationbetweenattsitesonthephageandbacterialchromosomesallowsintegrationoftheprophageFig.14.22bErrorsinprophageexcisionproduce

specializedtransducingphageAdjacentgenesareincludedincircularphageDNAthatformsafterexcisionFig.14.22cλdgal+侵染gal–菌株通过λ携带的gal+与受体基因gal–进行同源配对，经双交换，产生重组的gal+转导子，这种转导子是非溶源性的，稳定的。

λdgal+整合到受体染色体的gal–基因旁边，不稳定1946年第11届冷泉港会议上Hershey和Luria宣布发现噬菌体r、h突变，Delbruck和Hershey发表了噬菌体重组实验。三人获1969年NobelPrize噬菌体突变影响生活周期，会产生不同的噬菌斑。可以通过观察噬菌斑的形态来鉴别噬菌体的基因型。单个噬菌体的突变必须电镜才能鉴定。噬菌体重组与作图：（1）噬菌斑的形态：（2）宿主范围：h-：噬菌体能在E.coliB和B/2品系上生长，在B和B/2

混合菌苔上产生透明斑。h+：只能在E.coliB品系上生长，在B和B/2混合菌苔

上产生半透明斑。Hershey使用的两个表型特征：T2r-：快速溶菌，噬菌斑大，边缘清楚。r+：噬菌斑小，边缘模糊。B和B/2混合菌苔噬菌斑与基因型噬菌体杂交：1.亲本噬菌体（T2）基因型：h-r+：透明，小斑，边缘模糊。h+r-：半透明，大斑，边缘清楚。2.杂交过程——混合感染实验：两个亲本噬菌体混合感染E.coliB菌株，子代噬菌体通过感染B和B/2菌株，观察菌苔上出现的噬菌斑特征，推断子代噬菌体的基因型。（mixedinfectionexperiments）大半透明大透明小半透明小透明杂交结果：在B和B/2混合菌苔上出现了4种噬菌斑：噬菌斑表型推测基因型亲本型透明小h-r+半透明大h+r-重组型半透明小h+r+透明大h-r-重组机理：h+r-h+r-h+r-h-r+h-r+h-r+h+r-h+r-h+r-h-

r+h-

r+h-

r+噬菌体染色体在细菌体内复制不同的噬菌体染色体在细菌体内交换重组h+r+h+r-h+r-h-

r+h-

r+h-r-h+r+h+r-h-r+h-r-释放出4种子代噬菌体部分噬菌体DNA重组噬菌体重组值计算与基因作图：1.重组值的计算：重组噬菌体的噬菌斑数总噬菌斑数×100%2.基因图距：用两个基因的重组值表示基因间的遗传距离。（h+r+

+h-

r-

）totalplaques×100%Hershey和Rotman1949年的T2杂交结果基因型噬菌斑百分率h-

r+4276%h+r-34h+r+1224%h-

r-12rh24四种噬菌斑数及重组值杂交组合

每种基因型的%

重组值r–h+r+h–r+h+r–h–ra–h+

r+h–rb–h+

r+h–rc–h+×r+h–34.032.039.042.056.059.012.05.90.712.06.40.924%12.3%1.6%

ra–h+

r+h–

→24%

rb–h+

r