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文档简介

生物技术制药—动物细胞工程制药基础动物细胞工程制药

主要内容动物细胞的结构和生理特性动物细胞工程的常用操作技术

动物细胞工程制药过程动物细胞工程制药实例要求掌握动物细胞培养技术的要点通过具体实例掌握动物细胞工程制药的过程动物细胞工程制药

动物细胞的结构动物细胞形态动物细胞工程制药

动物细胞的结构质膜(plasmamembrane)细胞的屏障、细胞内外物质交换的通道,具有流动性细胞质(cytoplasm)非均质,含有大量的细胞器细胞核(nucleus)遗传物质的储存地,含细胞的全套遗传信息胞外基质(extracellularmatrix)存在于细胞间的大分子结构,以多糖及糖蛋白为主

动物细胞没有细胞壁!动物细胞工程制药

动物细胞的生理特性细胞的全能性(totipotency)分化的细胞保留着全部的核基因组,具有全套遗传信息,具有发育成完整个体的潜能证明:克隆羊Dolly的诞生细胞分化(differentiation)细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程时间上:一个细胞在不同发育阶段可以形成不同的形态和功能空间上:一个细胞在所处环境或部位不同可以形成不同的形态和功能组织和器官的形成动物细胞工程制药

动物细胞的生理特性细胞的衰老和凋亡细胞衰老(senescence)细胞增殖能力逐渐减弱衰老与染色体端粒的缩短有关细胞坏死(necrisis)细胞受到外界物理、化学因素的损伤而引起的死亡细胞解体,炎症反应细胞凋亡(apoptosis)“程序性细胞死亡”,即细胞外信号诱发的细胞自杀程序凋亡的意义:保证个体的正常生长、发育和维持生理功能动物细胞工程制药

动物细胞工程的常用操作技术细胞工程(cellengineering)利用细胞生物学和分子生物学等方法,有目的地利用或改造生物遗传性状,以获得特定的细胞产品、药品或新型物种的综合技术体系细胞培养、组织培养及其放大细胞融合育种细胞核移植与克隆染色体工程干细胞工程动物细胞工程制药

动物细胞工程的常用操作技术动物细胞融合(cellfusion)技术细胞核移植(nucleartransfer)技术动物细胞培养(cellculture)技术动物细胞工程制药

动物细胞融合技术把两个或多个真核细胞合并成为一个双核或多核细胞融合过程

Step1:细胞相互接触

Step2:细胞质膜的融合

Step3:细胞质的重组

Step4:细胞核的重组和遗传物质的合并、选择同核体基因型相同的细胞融合而得的多核细胞异核体

由不同基因型的细胞融合而得的多核细胞(杂种细胞),存活下来的细胞可分裂成两个合核体(单核杂种细胞)动物细胞工程制药

动物细胞融合技术细胞质膜的流动性是细胞融合的生物学基础动物细胞工程制药

动物细胞融合技术融合方法(1):仙台病毒诱导法仙台病毒(sendaivirus)又名日本血凝病毒(HVJ),是RNA病毒,其包膜上有很多刺突

HVJ磷脂外衣与细胞质膜相似,因此能与动物细胞质膜直接融合,如果HVJ同时接触到两个细胞就会打破细胞质膜的隔阂,引起两个细胞的融合

HVJ诱导细胞融合的能力与其核酸无关,可以用UV照射HVJ,破坏其核酸,使其失去感染能力需大量培养病毒,再灭活,存在感染风险,目前已少用动物细胞工程制药

动物细胞融合技术融合方法(1):仙台病毒诱导法操作两种细胞在一起培养,加入HVJ病毒,在4oC条件下,使足够量的病毒颗粒附着在细胞膜上,并使细胞相互聚集在37oC下温育,病毒包膜与细胞膜发生作用,细胞质膜受到破坏,此时需要Ca2+和Mg2+,最适pH为~

细胞质膜连接部穿通,细胞质相互渗透,HVJ也随之进入细胞质周边连接部修复,此时需Ca2+和ATP供能融合成新的细胞,仍需ATP参与供能动物细胞工程制药

动物细胞融合技术融合方法(2):聚乙二醇(PEG)诱导融合常用的PEG相对分子质量为200~20,000

原理:PEG分子具有轻微的负极性,能与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键,从而在质膜之间形成分子桥,使细胞质膜发生粘连,促使质膜的融合

PEG能增加类脂膜的流动性,也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能不受物种限制,融合率较高,异种细胞融合率10~35%PEG对细胞具有一定毒害作用动物细胞工程制药

动物细胞融合技术融合方法(2):PEG诱导融合动物细胞工程制药

动物细胞融合技术融合方法(3):电诱导融合利用电场诱导细胞连接成串,再施加瞬间强脉冲,可逆性击穿质膜

原理:在直流电脉冲的诱导下,细胞质膜表面的氧化还原电位发生改变,使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭合成完整的质膜,形成融合体融合率高、重复性好、对细胞伤害小已开发出商品化的电诱导融合仪器动物细胞工程制药

动物细胞融合技术融合细胞的筛选

——融合细胞同时具有两个亲本的标记特征抗药性筛选:细胞对药物敏感性差异营养互补筛选:双营养缺陷型物理筛选:显微镜下挑选荧光标记筛选:荧光显微镜、流式细胞仪动物细胞工程制药

动物细胞融合技术流式细胞仪动物细胞工程制药

动物细胞工程的常用操作技术动物细胞融合(cellfusion)技术细胞核移植(nucleartransfer)技术动物细胞培养(cellculture)技术动物细胞工程制药

细胞核移植技术将外源细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中,构建重组胚胎,经体外培养再移植入代孕母体内,使其发育为含有与供体细胞相同遗传物质的个体动物细胞工程制药

细胞核移植技术核移植操作

a.核受体与核供体细胞准备

b.分别取出受体和供体细胞的细胞核

c.供体细胞核移入去核的受体细胞中

d.激活重组胚胎的发育程序

e.重组胚胎体外培养

f.重组胚胎移植动物细胞工程制药

细胞核移植技术体细胞克隆——Dolly的诞生动物细胞工程制药

细胞核移植技术体细胞克隆——Dolly的档案名字:Dolly(编号:6LL3) 性别:雌出生日期:1996年7月5日出生地点:英国爱丁堡市罗斯林研究所死亡日期:2003年2月14日死亡原因:被确诊患进行性肺病后处以安乐死创造者:伊恩·维尔穆特(Wilmut)及其领导的小组基因父亲:无基因母亲:一只芬兰多塞特(FinnDorset)白面绵羊线粒体/细胞母亲:一只苏格兰黑脸(ScottishBlackface)羊生育母亲:另一只苏格兰黑脸羊子女:生育6名,存活5名动物细胞工程制药

细胞核移植技术体细胞克隆——Dolly的诞生取一只6岁大的妊娠FinnDorset母羊乳腺细胞作为核供体,体外培养3~6代注射促性腺素释放激素(GnRH)促使ScottishBlackface母羊排卵,于注射后28~33h取卵母细胞,尽快去核,并在特定缓冲液中恢复,然后转入37oC的M2培养基中,在5天内使培养基中血清从10%降到0.5%,使细胞停止在G0期利用电脉冲诱导供体细胞融入去核卵母细胞,并活化将重组胚植入羊的结扎输卵管内,6天后再移植到假孕受体母羊子宫内继续发育,最后产下Dolly动物细胞工程制药

动物细胞工程的常用操作技术动物细胞融合(cellfusion)技术细胞核移植(nucleartransfer)技术动物细胞培养(cellculture)技术动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞培养的特点动物细胞对营养的要求较高动物细胞在体外对培养环境的适应性较差,生长缓慢,培养时间长对环境条件要求较苛刻动物细胞培养基容易感染微生物,因此对无菌的要求高细胞体外培养的形态、功能等与体内存在差异绝大部分哺乳动物细胞具有贴壁生长特性动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞培养器具动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞的培养条件清洁无菌、无污染的环境——无菌操作要求高适宜的温度——细胞对温度变化敏感溶解氧、CO2、pH值——影响细胞内的酸碱平衡营养成分——培养基成分复杂

渗透压——防止细胞胀破附着物——基质或载体代谢副产物和抑制物动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞培养基和添加剂水:高纯水碳源:葡萄糖(常用)无机盐:Ca2+、Mg2+、K+、Na+、SO42-、Cl-、HCO3-、H2PO4-

微量元素:Cu、Fe、Mo、Zn、Mn、Se……

氨基酸:Gln、Asn、Arg、Lys……

维生素:主要是B族维生素

血清:>5%(或血清替代物)其他:肌醇、丙酮酸、次黄嘌呤、GSH、氯化胆碱、脂类、酸碱指示剂(酚红)动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞培养基和添加剂——血清血清的成分蛋白质:白蛋白、球蛋白、转运铁蛋白等激素:主要是细胞因子类,如生长因子等代谢物、营养物、无机盐抑制物血清营养丰富,极易染菌、染毒血清批次之间性质有差别,质量不稳定成本高昂,且对产物分离有一定影响动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞在体外培养时的形态贴壁细胞贴附在支持物表面,依靠贴附因子在该表面上生长、增殖主要形态:成纤维样细胞、上皮样细胞、游走型细胞悬浮细胞不依赖于支持物表面,可以悬浮生长,细胞一般呈球形兼性贴壁细胞不严格依赖支持物,在不同的培养条件下以贴壁或悬浮状态生长、增殖动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞在体外培养时的形态贴壁生长的SW620细胞贴壁生长的胰岛细胞株RINm5f动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞生长的三个阶段原代培养期(primaryculture)从机体取得材料(细胞、组织或器官),接种培养到第一次传代前的阶段这一阶段细胞比较活跃,细胞多呈二倍体核型传代培养期(passageculture)在原代培养后期,将原代培养的细胞分离、稀释并接种到新培养基上继续扩大培养的阶段原代细胞一经传代后便称为细胞系细胞增殖旺盛,维持二倍体核型,称为二倍体细胞系衰退期细胞增殖很慢或不增殖,开始衰退凋亡动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞培养方法

(依据细胞在反应器内生长形式的不同而划分)贴壁培养(anchorage-dependentculture)细胞贴附在一定的固相表面进行的单层培养悬浮培养(suspensionculture)细胞自由地悬浮于培养液中生长增殖固定化培养(immobilizationculture)将细胞定位或限制在特定空间内进行生长、增殖动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞贴壁培养(anchorage-dependentculture)贴壁依赖型细胞一经贴壁就在培养容器表面迅速铺展,然后进行有丝分裂,并很快进入对数生长期优点容易更换培养液,毋需过滤便于采用灌流式培养,能提高细胞密度细胞能更加高效表达产品缺点扩大培养较困难传代必须采用蛋白酶等消化处理不能有效监测细胞生长动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞贴壁培养(anchorage-dependentculture)贴壁培养的材料:表面具有净正电荷和高表面活性明矾-硅硼酸玻璃聚苯乙烯塑料金属:不锈钢和钛微载体:天然葡聚糖或其他天然、合成聚合物,如Cytodex动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞悬浮培养(suspensionculture)主要适用于非贴壁依赖型细胞,如杂交瘤细胞、血液白细胞、淋巴细胞等可采用搅拌式反应器或气升式反应器优点细胞传代时毋需消化放大容易,也便于在线监测缺点细胞相对密度较低

不适用于正常组织细胞的培养(包括二倍体细胞)动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞固定化培养(immobilizationculture)对贴壁依赖型和非贴壁依赖型细胞均适用固定化方法吸附法:细胞通过非共价作用附着于载体表面包埋法:将细胞包埋在多孔载体内微囊法:用亲水性半透膜将细胞包围在珠状微囊中自絮凝法:许多哺乳动物细胞系在无血清培养时,具有相互凝集形成细胞团的趋势,这种细胞团类似于微载体动物细胞工程制药

动物细胞培养技术动物细胞培养操作方式分批培养(batchculture)流加培养(fedbatchculture)半连续培养(semi-continuousculture)灌流培养(perfusedculture)在细胞增长和产物形成过程中,不断取出部分培养基(含有细胞代谢废物),并补充新鲜培养基取出培养基时,细胞仍保留在反应器内,而半连续培养则同时取出细胞贴壁依赖型细胞特别适合灌流培养动物细胞工程制药

动物细胞工程制药过程细胞系的选择基因工程细胞构建细胞库的建立种子细胞的保存、复苏和鉴定细胞培养药物分离纯化药品制剂动物细胞工程制药

(一)细胞系的选择药物生产用动物细胞的来源

a.原代细胞直接取自动物组织、器官,经粉碎、消化而得细胞密度:109/g,能利用的只是其中一小部分鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、血液淋巴细胞等

b.二倍体细胞系一般从动物胚胎组织获取染色体组型为2n核型贴壁依赖、接触抑制增殖能力有限无致瘤性动物细胞工程制药

(一)细胞系的选择药物生产用动物细胞的来源

c.转化细胞系通过正常细胞转化而来染色体断裂成异倍体能无限增殖

d.融合细胞系——杂交细胞系

e.基因工程细胞系在基因水平上进行操作构建的细胞通过基因工程技术,在分子水平上进行基因设计、改造、重组,再转移至新的宿主细胞系统内进行复制、表达和折叠,以产生新的功能蛋白动物细胞工程制药

(一)细胞系的选择几个概念细胞系(cellline)由原代培养经传代培养纯化,获得的能在体外生存的细胞群体有限细胞系:不能连续培养的细胞系连续细胞系:能连续培养下去的细胞系,也称为无限细胞系细胞株(cellstrain)从一个经过生物学鉴定的细胞系中,用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群动物细胞工程制药

(一)细胞系的选择几个概念单倍体(n)体细胞中含有本物种配子染色体数目(即体细胞染色体数目的一半)的个体,通常由未受精的生殖细胞直接发育而来二倍体(2n)体细胞中含有两个染色体组的个体,由受精卵发育而来多倍体体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体,由受精卵发育而来。在植物中经常出现,但动物中较少见异倍体具有不成套染色体组的细胞或个体动物细胞工程制药

常用的生产用动物细胞系

CHO-K1细胞(二倍体)

CHO细胞:Chinesehamsterovarycell,中国仓鼠卵巢细胞从中国仓鼠卵巢中分离的一株上皮样细胞核型:2n=20~22

二氢叶酸还原酶营养缺陷突变株CHO-dhfr-

DMEM培养液,含脯氨酸(Pro)、次黄嘌呤、胸苷、小牛血清等动物细胞工程制药

常用的生产用动物细胞系

BHK-21细胞(二倍体)

BHK细胞:babyhamsterkidneycell,幼仓鼠肾细胞用单细胞分离方法经13次克隆的叙利亚幼仓鼠肾细胞成纤维样细胞核型:2n=44DMEM培养液,添加7%胎牛血清动物细胞工程制药

常用的生产用动物细胞系

WI-38细胞(二倍体)从女性高加索人的正常肺胚组织中获得的人源细胞系核型:2n=46

成纤维细胞,产胶原

BME培养液,加10%小牛血清,pH控制在

倍增时间24h,有限寿命50代动物细胞工程制药

常用的生产用动物细胞系

MRC-5细胞(二倍体)从14周的正常男性胚肺组织中获得的细胞系核型:2n=46

成纤维细胞

BME培养液,加10%小牛血清有限寿命42~46代增殖速率比WI-38快,对不良环境敏感性比WI-38低动物细胞工程制药

常用的生产用动物细胞系

Namalwa细胞人的类淋巴母细胞(人工构建)最初来源:从肯尼亚Burkitt淋巴瘤患者体内获得完全分化的B淋巴细胞,能大量分泌免疫球蛋白有2.8%的高倍体率

12~14条标记染色体,单条X染色体,无Y染色体

RPMI1640培养基,添加7%胎牛血清含有部分EB病毒基因,但不产生EB病毒(人类疱疹病毒HHV-4)动物细胞工程制药

常用的生产用动物细胞系

Vero细胞(二倍体)从正常的成年非洲绿猴肾中分离获得核型:2n=60,高倍体率约17%

贴壁依赖型成纤维细胞

199培养液,添加5%胎牛血清可支持多种病毒增殖并制成疫苗

Sf-9细胞(昆虫细胞)从秋黏虫的蛹卵组织中分离并克隆得到对苜蓿尺蠖核型多角体病毒和其他杆状病毒高度敏感

Grace培养基,添加水解乳蛋白、酵母浸出液和胎牛血清动物细胞工程制药

(二)基因工程细胞的构建:1)腺病毒真核细胞基因表达载体(哺乳动物系统)腺病毒(Adenovirus)载体

无包膜的线性双链DNA病毒,由252个壳粒以二十面体排列而成动物细胞工程制药

(二)基因工程细胞的构建:2)SV40病毒真核细胞基因表达载体(哺乳动物系统)猿空泡病毒40(Simianvirus40,SV40)致瘤病毒,寄生于多种灵长目动物体内动物细胞工程制药

(二)基因工程细胞的构建:2)SV40病毒

SV40病毒的特征无被膜,62个核壳粒亚单位共价闭环双链DNA,基因组5.2kb

感染之后的SV40基因组,输送到细胞核内进行转录和复制可使猴源细胞发生裂解性感染,人体感染后细胞裂解率约1~2%,在啮齿动物体内不裂解细胞,但发生癌变基因组中存在着一个增强子序列,长度72bp,可以增强由细胞启动子启动的基因转录作用——构建质粒动物细胞工程制药

(二)基因工程细胞的构建:2)SV40病毒基于SV40的载体含SV40的复制起始位点ori,含有功能性SV40早期或晚期启动子在SV40大T抗原(一种肿瘤抗原)存在下,载体能够在SV40病毒复制许可性细胞中复制取代型重组病毒载体——外源DNA直接插入缺陷性的病毒基因组中重组病毒-质粒载体——病毒基因组部分仅保留了维持在哺乳动物细胞中进行复制所必须的有关序列,但它融合了细菌质粒,可在原核细胞中复制、增殖动物细胞工程制药

(二)基因工程细胞的构建:2)SV40病毒取代型重组病毒载体——COS细胞用复制起点缺失SV40的基因组DNA转化非洲绿猴肾细胞CV-1获得3个细胞系:COS-1、COS-3、COS-7

SV40复制起点缺失,但SV40早期启动子未被破坏组成性表达SV40大T抗原,能使大多数哺乳动物细胞携带有SV40ori

复制子的质粒以附加体形式高拷贝扩增,从而有效表达和分泌重组蛋白动物细胞工程制药

(二)基因工程细胞的构建:2)SV40病毒重组病毒-质粒载体动物细胞工程制药

(二)基因工程细胞的构建:2)SV40病毒

SV40载体的特点可在多种哺乳动物细胞中表达,转染COS细胞可获得高水平表达可表达cDNA,对外源DNA片段长度没有限制一般作为瞬时表达系统(外源基因进入受体细胞后,未整合进受体细胞基因组而立即转录,出现基因产物)载体中一般含有SV40复制起点、宿主范围广泛的启动子、寡聚poly(A)加尾信号、剪接供体和受体信号动物细胞工程制药

(二)基因工程细胞的构建:3)杆状病毒真核细胞基因表达载体(昆虫系统)杆状病毒(baculovirus)载体出芽型病毒粒子包埋型病毒粒子动物细胞工程制药

(二)基因工程细胞的构建:3)杆状病毒真核细胞基因表达载体(昆虫系统)杆状病毒载体具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒,基因组80~180kb,以节肢动物(尤其是昆虫)作为专一性宿主进行感染和传播具有两种不同的病毒粒子形态出芽型的病毒粒子(buddedvirus,BV),主要介导细胞与细胞之间的系统感染,入侵细胞通过受体介导的内吞作用包埋型的病毒粒子(occlusion-derivedvirus,ODV),在病毒口服感染过程中,以直接的膜融合方式入侵中肠上皮细胞动物细胞工程制药(二)基因工程细胞的构建杆状病毒生活史病毒组装成包埋小体,被人工喷洒在植物叶子上昆虫觅食,食入包埋小体病毒包埋小体进入昆虫的消化道内腔病毒颗粒从包埋小体中释放,接近肠道绒毛边缘,融合,侵入病毒在昆虫的细胞核内复制,获得子代病毒,释放到细胞质及血腔中,继续感染其他细胞动物细胞工程制药

(二)基因工程细胞的构建:3)杆状病毒真核细胞基因表达载体(昆虫系统)杆状病毒载体的特点高度特异性的宿主范围,容易重组外源基因插入容量较大(>7kb)病毒中的多角体蛋白与病毒的形成无直接关系,可用外源基因替换多角体蛋白基因多角体蛋白基因有强启动子多角体显微可见,可作为筛选标记动物细胞工程制药

(三)细胞库的建立原始细胞库(mastercellbank,MCB)由单一来源的均质细胞所构建的细胞库,对于二倍体细胞应该是群体倍增水平尽可能低的细胞建立详细的细胞档案细胞系的历史细胞的形态和生长特性种源特性用于生产的重组细胞,需有载体构建资料细胞系的稳定性有害因子检查报告动物细胞工程制药

(三)细胞库的建立生产用细胞库(manufacturer’sworkingcellbank,MWCB)经检定合格后的细胞按生产条件大量培养、冻存的细胞管为生产细胞库从MCB细胞而来,是提供生产用细胞的唯一来源生产时取出后不再回冻需确定其最高使用的传代次数此段时间内可生产多个批号的产品,但此段时间结束时该细胞废弃,从MWCB中开启新管需建立档案需进行无菌检验和无细胞交叉污染检验动物细胞工程制药

(四)种子细胞的冻存和复苏细胞冻存液氮低温冻存(-196oC)保护剂:甘油、二甲基亚砜(DMSO)降温速率:一般1oC/min

细胞复苏快速融化用70%乙醇消毒除去保护剂,加入新鲜无菌培养基动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例促红细胞生成素 (erythropoietin,EPO)重组乙型肝炎疫苗 (recombinanthepatitisBvaccine)动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(一)促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)由肾脏分泌的一种酸性糖蛋白激素,又称血细胞生成素、红细胞刺激因子

1906年发现,1972年从肝脏中纯化制得,1978年从肾脏中纯化制得

1983年10月,Amgen公司成功克隆了EPO基因

1985年科学家应用基因重组技术,在实验室获得重组人EPO(rhEPO),并利用基因重组技术开始大批量生产重组人促红细胞生成素

1989年,FDA批准了Amgen公司的EPO产品(商品名:Epogen)在临床上的使用动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(一)促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)成熟的EPO由166个氨基酸残基构成,相对分子质量36kDEPO空间结构由4个反向平行的-螺旋构成动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(一)促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)成熟的EPO由166个氨基酸残基构成

pI=,相对分子质量34~39kD

含有两对二硫键

Cys7—S—S—Cys161Cys29—S—S—Cys33

酸性糖蛋白

N-糖基化位点:Asn24、Asn38、Asn83

O-糖基化位点:Ser126

糖链中的唾液酸(sialicacid)对EPO的活性至关重要动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(一)促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(一)

EPO的功能和应用

与骨髓内红系前体细胞表面特异性EPO受体结合,促进血红蛋白的合成,并诱导红细胞的增殖和分化,调节体内红细胞和血红蛋白的生理平衡。主要用于治疗各种疾病所并发的贫血症状。动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(一)

EPO的表达生产人EPO基因位于7号染色体,有5个外显子和4个内含子由于糖基及糖基化水平对EPO的活性至关重要,因此EPO基因主要在哺乳动物细胞内进行表达,目前主要采用CHO-dhfr-将含有人EPO基因的重组质粒经酶切,转染CHO-dhfr-细胞,以MTX(甲氨喋呤)筛选高效表达细胞株动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(一)

EPO的生产过程工作细胞复苏从生产用细胞库取出一支细胞株,化冻在超净台内转移到约10ml含有10%胎牛血清的培养基中,在37oC含5%CO2

的培养箱中培养第二天更换新鲜培养基,继续培养至贴壁覆盖率达到85%以上时,传代扩增动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(一)

EPO的生产过程细胞扩增和表达培养胰蛋白酶消化,按合适比例传代扩增消化细胞,收集计数,接种至反应器或转瓶中,用含10%小牛血清的培养基扩增培养细胞密度≥107/ml时更换为无血清培养液在表达过程中应适当提高培养液中的葡萄糖浓度,并添加少量乳酸等保持培养液在较低的pH值在反应器中培养30天左右动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(一)

EPO的生产过程分离纯化和精制

EPO富集:培养上清液先用BlueSepharoseFF染料亲和层析,再经POROS50R1反相吸附剂处理,吸附EPO,除去大部分细胞色素,并浓缩蛋白,而后洗脱离子交换层析:洗脱液用DEAE40HR离子交换层析分离,梯度洗脱,收集目标蛋白峰精制:用Sephacryl200精细纯化,可得纯度98%以上,比活≥1.5×105IU/mg的rhEPO纯品洗脱液冻干,制剂动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(一)

EPO的修饰品——新型红细胞生成刺激蛋白NESPNESP:novelerythropoiesisstimulatingproteinAmgen公司开发,商品名AranespTM,2001年FDA批准上市

EPO的血浆半衰期(6~8h)短,需频繁注射

NESP增加了5个氨基酸序列,新增2个N-糖基化位点延长了半衰期(21~25h),一周只需注射一次动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(二)重组乙型肝炎疫苗(RecombinantHepatitisBVaccine)乙型肝炎病毒(HBV)是由Dane于1970年发现

HBV直径42nm,包膜由乙肝表面抗原蛋白组成,无感染性内含一直径27nm的核心动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(二)乙型肝炎疫苗的基因

HBV基因组为部分双链环状DNA,长3.2kb,有4个蛋白编码区(C、P、X、S)

S区基因编码的S蛋白是乙肝表面抗原的主要成分小蛋白、中蛋白、大蛋白动物细胞工程制药

动物细胞工程制药实例(二)乙型肝炎疫苗

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