蛋白质定量新技术的调研法则

蛋白质定量新技术的调研法则蛋白质定量问题：一、蛋白质的定量包括绝对定量和相对定量。二、蛋白质定量的研究对象包括：1、纯化后蛋白质的绝对定量；2、总蛋白质的绝对定量；3、复杂生物体系中一种或数种蛋白质的绝对和相对定量；4、复杂生物体系中大多数及全部蛋白质的绝对和相对定量。蛋白质定量新技术的调研法则蛋白质定量的常用方法1、基于光吸收或发射性质的光谱定量方法，如紫外及可见光吸收和荧光定量方法；2、基于色谱或毛细管电泳与紫外光吸收定量方法；3、基于同位素稀释的质谱定量方法；4、基于凝胶电泳和光密度度的定量方法；5、基于抗体和荧光标记的定量方法；6、蛋白质相对定量方法。蛋白质定量新技术的调研法则国内外研究现状1、绝对定量方法（1）光谱定量

280nm光吸收蛋白质定量法；

LOWRY蛋白质定量法或改进LOWRY蛋白质定量法；

BCA蛋白质定量法法；

BRADFORD蛋白质定量法；

Fluoraldehyde蛋白质定量法；

ELISA蛋白质定量法等。蛋白质定量新技术的调研法则(2）稳定同位素稀释法（内标法）用于质谱法进行蛋白质的绝对定量；（3）多反应检测蛋白质或肽定量法；（4）规模化蛋白质的半绝对定量方法（基于统计方法）。采用蛋白鉴定的分值与相应蛋白质的丰度的关系进行半定量的方法；蛋白质丰度指数（PAIs，proteinabundanceindices）与相应蛋白质丰度的关系进行半定量的方法；指数蛋白质丰度指数（emPAIs，exponentiallymodifiedproteinabundanceindices）与相应蛋白质丰度的关系进行半定量的方法。蛋白质定量新技术的调研法则2、相对定量方法（1）在蛋白质水平上，基于两维分离或与荧光标记结合的比较方法，如2DE、PF-2D和DIGE；（2）基于质谱技术的不同状态的同一种肽段提取的离子流色谱图比较的方法（非标记定量）；（3）稳定同位素标记方法，包括化学标记和代谢标记，如18O

水标记、同位素酸酐试剂标记、同位素醛试剂标记、

cICAT、iTRAQ和SILAC等;（4）双功能试剂结合金属标记的方法;(5)同系物标记-SDS或2DE结合质谱的蛋白质相对定量方法。关键是：没有我们自己创新的技术方法；现有的方法在规模化蛋白质定量时的动态范围、灵敏度、标记反应的完全程度、样品量和成本方面还无法完全满足蛋白质科学信息化发展的要求；另外，没有规模化蛋白质绝对定量方法。蛋白质定量新技术的调研法则研究目标一、复杂生物样本中蛋白质或肽绝对定量方法；二、规模化蛋白质绝对定量方法的建立；三、多重规模化蛋白质相对定量方法。蛋白质定量新技术的调研法则复杂生物样本中蛋白质定量文献调研蛋白质定量新技术的调研法则基于内标法（同位素稀释法）进行蛋白质质谱绝对定量AbsolutequantificationofproteinsandphosphoproteinsfromcelllysatesbytandemMSScottA.Gerber,JohnRush,OlafStemman,MarcW.Kirschner,andStevenP.GygiPNAS2003;100;6940-6945;originallypublishedonlineMay27,2003;1、合成带有稳定同位素标记的肽段作为内标；2、合成的肽段可以进行磷酸化、乙基化、乙酰化等修饰；3、采用SIM技术对有限、重要部分蛋白质进行绝对定量。蛋白质定量新技术的调研法则AbsoluteQuantificationofProteinsinSolutionsandinPolyacrylamideGelsbyMassSpectrometryJanHavlisandAndrejShevchenkoAnal.Chem.2004,76,3029-30361、将nano-ESI质谱与18O标记肽内标法结合用于溶液或胶上酶切蛋白质的绝对定量；2、实验结果表明溶液酶切绝对定量更为准确，而胶上酶切的准确度受回收率影响较大，因此肽段的选择更为重要；3、在优化的实验条件下，胶上酶切法可以给出误差小于50％的半定量结果。蛋白质定量新技术的调研法则Quantitativemousebrainproteomicsusingculture-derivedisotopetagsasinternalstandardsYasushiIshihama,ToshitakaSato,TsuyoshiTabata,NorimasaMiyamoto,KojiSagane,TakeshiNagasu&YoshiyaOdaNATUREBIOTECHNOLOGY，VOLUME23NUMBER5MAY2005:617-6211、报告了一种基于同位素培养标记（CDIT,culturederivedisotopetads）用于组织样本的蛋白质组绝对定量方法；2、基本思想是首先对neuro2A细胞进行同位素介质培养标记；3、用合成的肽段作为内标对neuro2A细胞中的相关蛋白质进行绝对定量，然后将该细胞作为内标，对同源率97-98％的脑组织进行绝对定量，获得了103中蛋白质的绝对定量信息。蛋白质定量新技术的调研法则MultiplexedabsolutequantificationinproteomicsusingartificialQCATproteinsofconcatenatedsignaturepeptidesRobertJBeynon,MaryKDoherty,JulieMPratt1&SimonJGaskellNATUREMETHODS，VOL.2NO.8AUGUST2005:587-5891、基于同位素标记相似物作为内标对具有代表性肽段进行定量，进而对相应的蛋白质进行定量；2、设计了一种基因编码不同蛋白质中特定肽段于一种蛋白质（QCATprotein,concatenatedprotein）并在中进行表达、纯化并用于蛋白质绝对定量的方法。蛋白质定量新技术的调研法则MultiplexedProteinQuantitationinSaccharomycescerevisiaeUsingAmine-reactiveIsobaricTaggingReagentsPhilipL.Ross,etalMolecular&CellularProteomics,2004,3(12):1154-1169蛋白质定量新技术的调研法则基于iTRAQ基本原理进行蛋白质组绝对定量

IsobaricTagsforRelativeandAbsoluteQuantitation(iTRAQ)Reproducibility:ImplicationofMultipleInjectionsPohKuanChong,CheeSianGan,TrongKhoaPham,andPhillipC.WrightJournalofProteomeResearch2006,5,1232-1240通过多次进样对iTRAQ方法的重现性进行考察，表明该方法具有较好的重现性，CV（coefficientofvariation)为。因此，多次样品分析是必要的。蛋白质定量新技术的调研法则基于凝胶电泳进行蛋白质绝对定量方法Assessingfactorsforreliablequantitativeproteomicsbasedontwo-dimensionalgelelectrophoresisJulieFiévet,ChristineDillmann,GillesLagniel2,MarlèneDavanture,LucNegroni,JeanLabarreandDominiquedeVienneProteomics2004,4,1939–19491、基于对2DE中的一种蛋白质进行35S放射性同位素标记，然后进行考马氏亮蓝G250染色；2、采用Kepler,Image-QuaNT,Melanie3.0等软件对其他蛋白质点进行比较定量；3、对大多数糖解蛋白质酶进行了绝对定量。蛋白质定量新技术的调研法则非标记（labelfree）定量模型蛋白质定量新技术的调研法则Yates实验室的Liu等提出，蛋白质的量与其被质谱鉴定到的肽段数正相关，并用实验予以初步证明。该方法的动态范围达到2个数量级以上。蛋白质定量新技术的调研法则该文初步建立了基于spectralcount的蛋白质组定量模型,讨论了该模型的可行性,并运用于相对简单标准蛋白质样品蛋白质在每个细胞中的拷贝数(丰度),与其spectralcounts的关系蛋白质定量新技术的调研法则Molecular&CellularProteomics4:1265-1272,2005本文提出了几个公式,用来对spectralcount进行归一化处理分子,分母分别表示某个蛋白质在质谱中实际观测的和理论的肽段数通过归一化,将蛋白质对应的spectralcounts转化为质量百分比或摩尔百分比蛋白质定量新技术的调研法则该图显示的是不同归一化指标与蛋白质浓度的关系,该图告诉我们emPAI与蛋白质浓度的线性关系最好(图E,F)该模型的前提是对肽段的理论个数和理论流出时间进行预测,优势在于可以对样品中的每个蛋白质进行归一化处理,使不同结果更具有可比性蛋白质定量新技术的调研法则

该文在Spectralcount模型基础上建立了Rsc的归一化方法,并与基于肽色谱峰面积的定量方法进行了比较.表明两种方法具有较好的相关性Molecular&CellularProteomics4:1487-1502,2005n1,n2

分别为两组差异样品中某个蛋白质的spectralcounts;t1,t2

分别为两组差异样品中所有蛋白质spectralcounts的总和;f1,f2

分别为校正系数.蛋白质定量新技术的调研法则1、该文建立了一种蛋白质表达绝对定量的模型(APEX)2、该模型基于蛋白质被质谱检测的spectralcounts和肽段鉴定概率3、通过该模型对酵母和大肠杆菌蛋白质组进行定量分析,其结果与westernblotting,2DE,mRNA结果一致Publishedonline24December2006,doi:10.1038/nbt1270蛋白质定量新技术的调研法则对于给定的蛋白组混合物，理论肽段占总肽段的分数近似等于实际测定的MSMS扫描次数占总扫描次数的分数蛋白质定量新技术的调研法则ComputationalpredictionofproteotypicpeptidesforquantitativeproteomicsBernhardKuster&RuediAebersold,etalNATUREBIOTECHNOLOGY，2007，VOLUME25NUMBER1:125-1311、假设一：混合物中存在的任何一种蛋白质的所有肽段出现的几率是相同的；2、假设二：仅有一些蛋白质特有肽段总会被重复鉴定；3、通过四种蛋白质组学技术平台获得的600000鉴定的肽段，得到4030种酵母蛋白质的16000种特有肽段；4、基于这些肽段的特征理化性质，发展了一种计算机工具。该工具可以预测不同生物中蛋白质的特有肽段。对于不同\

的技术平台，累计准确度大于85％；5、特有肽段可以用于蛋白质鉴定结果的验证、蛋白质绝对定量、基因组编码序列的解释或质谱分析流程中某一因素的表征（酶解、色谱、离子化和裂解）。蛋白质定量新技术的调研法则Challengesinderivinghigh-confidenceproteinidentificationsfromdatagatheredbyaHUPOplasmaproteomecollaborativestudyDavidJStates,DavidWSpeicher&

SamirMHanash,

etalNatureBiotechnology24(3):333-338(2006)

由已知浓度的12种蛋白质(200pg/ml-20ng/ml)得到的近似公式：Log10(N)=0.365×log10上式中N为某一种蛋白质鉴定的肽段数；C为其浓度。由此公式可以策略估计样本中蛋白质的含量。蛋白质定量新技术的调研法则规模化蛋白质相对定量方法蛋白质定量新技术的调研法则iTRAQ基本原理蛋白质定量新技术的调研法则肝癌细胞SILAC定量技术路线甲胎蛋白阳性甲胎蛋白阴性蛋白质定量新技术的调研法则

反相液相色谱-双功能试剂-金属标签-液质联用蛋白质组相对定量新方法的研究及相关软件编制不同状态蛋白质提取液一维色谱分离双功能金属螯合试剂标记液－质联用分析酶切数据分析和总结混合馏分酶切蛋白质定量新技术的调研法则待测样本对照样本酶切合并样本1220130013801460m/z200400600800m/z0100LRRASLG|TbtagTbtagMSMS/MSDTPAA偶合YCl3TbCl3色谱分离Ｙtag蛋白质定量新技术的调研法则DTPAAcoupledSample1Sample2DigestionanddryDigestionanddryMix1DTPAA

coupledChemicalandProteolytic18OLabelingMassdifference2DainpeptideN-termMassdifference4DainpeptideC-termTotalMassdifference6Da

NooverlayinisotopepeaksChemical18OLabelingMassdifference2DainpeptideN-termNoexchangebetween16Oand18OLC-MS/MSH2OH218O37℃18h37℃18hLC-MS/MSMix2

反相液相色谱-双功能试剂-18O标签-液质联用蛋白质组相对定量新方法的研究及相关软件编制蛋白质定量新技术的调研法则

乙酸酐稳定同位素标记-液质联用蛋白质组相对定量新方法的研究及相关软件编制intensitym/zsampleAsampleBtrypsindigestionGAlabelingwith‘light’GAlabelingwith‘heavy’MSanalysis‘light’‘heavy’ε-aminogroupoflysineresidueisspeciallyblockedbyguanidinationreaction,andtheN-terminusoftheresultantpeptideislabeledbyd0-aceticanhydride