大肠细菌的基因芯片鉴定

大肠细菌的基因芯片鉴定第一页，共三十七页，编辑于2023年，星期日

基因芯片：

是指将特定的DNA或寡聚核苷酸片段通过物理化学方法固定于玻璃、尼龙甚至塑料片上,使多基因分析可同时进行的一种装置。基因芯片上可固定不同物种特定基因的探针，将从样品中提取并经PCR扩增和荧光标记的特异基因片段与基因芯片上的探针杂交，利用专门的光学仪器，能够检测到这些杂交信号（带有荧光标记的双链核酸），杂交信号出现在某物种的探针位点上，说明样品来自于该物种。第二页，共三十七页，编辑于2023年，星期日基因芯片上固定探针的方法

通过化学修饰可以使玻片成为表面富含氨基的基片。在中性溶液中，基片上的氨基所带的正电荷与核酸分子上的磷酸所带的负电荷相互作用，使核酸吸附在基片表面。加热和紫外照射可以增强固定效果，但紫外交联容易导致DNA断裂或DNA分子间形成干扰杂交的网状结构，所以一般还是采用加热固定。本实验使用的基因芯片上固定有大肠杆菌HSP70基因和黄单胞菌HTPG基因的特异探针，可用于鉴定这两种细菌。第三页，共三十七页，编辑于2023年，星期日基因芯片制作和检测的原理第四页，共三十七页，编辑于2023年，星期日实验方案

本实验共分为四个部分：一、大肠杆菌培养二、提取大肠杆菌基因组DNA

三、PCR扩增其HSP70基因，电泳检测扩增产物四、扩增产物与基因芯片杂交并检测杂交信号第五页，共三十七页，编辑于2023年，星期日第一部分细菌培养

配制100mlLB液体培养基，蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，加重蒸水100ml，用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。将大肠杆菌单菌落接种于LB培养基中，37℃恒温摇床上培养过夜，摇床转速约为280r/min。第六页，共三十七页，编辑于2023年，星期日第二部分

提取纯化大肠杆菌基因组DNA第七页，共三十七页，编辑于2023年，星期日第二部分实验步骤1、取培养的菌液10ml，4000r/min离心10min，除去上清液。2、加入1mlTE，使细菌沉淀充分悬浮。3、加入0.2ml10%SDS溶液，再加入10μl20mg/ml蛋白酶K，37℃水浴中温育1h。(SDS溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白。)4、取出离心管，加入0.2ml5mol/LNaCl溶液，混匀后再加入0.2mlCTAB/NaCl溶液，65℃水浴中温育20min。第八页，共三十七页，编辑于2023年，星期日5、加入与菌液等体积（1.6ml）的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，用漩涡混合器混匀，4000r/min离心10min。注意吸取混合液前将混合液充分振荡混匀。6、取上层水相至无菌离心管，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，用移液器反复吹打混匀，4000r/min离心10min。7、将上层水相转移到另一个无菌离心管中，加入2μlRNaseA，37℃水浴中温育30min。8、加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，充分振荡，抽提残留在水相中的苯酚。4000r/min离心10min。9、将上清液移至新的离心管中。第九页，共三十七页，编辑于2023年，星期日10、加入上清液1/10体积的3mol/LNaAc溶液，以及上清液2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀以沉淀DNA。室温下静置10min，DNA形成白色（或淡黄色）絮状沉淀。11、用移液器轻轻吸住白色絮状沉淀，将其转移到装有适量75%乙醇的1.5ml离心管中。上下颠倒漂洗，洗去杂质。7500r/min离心5min。12、去上清液，沉淀干燥后溶解于100μlTE中。第十页，共三十七页，编辑于2023年，星期日

取10μl提取的基因组DNA溶液加1.99ml水稀释后测量OD260，蒸馏水作为空白，计算DNA产量（1OD260＝50μgDNA/ml）。

-20℃贮存其余基因组DNA，待下一实验用作PCR反应的模板。

DNA产量测定第十一页，共三十七页，编辑于2023年，星期日试剂1、TE：10mmol/LTris·HCl，1mmol/LEDTA2、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）/NaCl：将4.1gNaCl溶解于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，定容至100ml。3、苯酚/氯仿/异戊醇混合液：水饱和酚:氯仿:异戊醇=25:24:1（体积比）。4、氯仿/异戊醇混合液：氯仿:异戊醇=24:1（体积比）。5、10μg/μlRNaseA10%SDS

20mg/ml蛋白酶K5mol/LNaCl

3mol/LNaAc无水乙醇75%乙醇。第十二页，共三十七页，编辑于2023年，星期日第三部分PCR扩增组

分

剂

量（μl）

基因组DNA模板10-100ng10×TaqBuffer34×dNTP（各10mol/L）0.5上游引物（HEX标记）1下游引物（HEX标记）1TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)0.5dH2O（随模板体积变化）总体积30第十三页，共三十七页，编辑于2023年，星期日PCR反应程序阶段温度时间

起始变性94℃3min变性94℃30s循环30次

退火60℃30s延伸72℃45s最后延伸72℃10min

第十四页，共三十七页，编辑于2023年，星期日第四部分

基因芯片杂交和检测第十五页，共三十七页，编辑于2023年，星期日每个阵列的探针排布标记有HEX的核酸（无标记的大肠杆菌HSP70基因扩增产物）（无标记的黄单胞菌HtpG基因扩增产物）50%DMSO第十六页，共三十七页，编辑于2023年，星期日器材耗材软件第十七页，共三十七页，编辑于2023年，星期日实验步骤（1）准备芯片：去掉杂交围栏上的胶纸，将杂交围栏放在杂交模具中心的同样形状的凹槽中，胶面朝上，注意要使杂交围栏与凹槽契合。用手捏着芯片上贴有标签纸的一端，将芯片另一端顶着模具的顶端，然后将芯片正面（贴有标签纸）朝下放入模具。在芯片背面相应位置用镊子轻轻向下按，使杂交围栏紧贴在芯片上。第十八页，共三十七页，编辑于2023年，星期日撕去围栏上的保护纸第十九页，共三十七页，编辑于2023年，星期日贴围栏第二十页，共三十七页，编辑于2023年，星期日第四部分实验步骤（2）往杂交盒底部凹槽中均匀加入少量蒸馏水（约200μl），以防止杂交过程中杂交液大量挥发。把芯片有杂交围栏的一面朝上放入杂交盒中，按芯片摆放方向盖上盖片，注意使盖片上的凸面朝下。盖片芯片标签端盖片正面观第二十一页，共三十七页，编辑于2023年，星期日往杂交盒底部的凹槽中加水第二十二页，共三十七页，编辑于2023年，星期日将贴好围栏的芯片放入杂交盒注意：围栏朝上第二十三页，共三十七页，编辑于2023年，星期日盖上盖片注意：盖片的凸起面向下第二十四页，共三十七页，编辑于2023年，星期日第四部分实验步骤（3）杂交：将杂交液用移液器混匀后3000r/min离心30s，95℃热变性3min。冰浴骤冷1min。用移液器将杂交液注入盖片上的小孔。盖上杂交盒的盖板，两侧用两个卡子扣上，确保杂交盒的密封性。在42℃水浴中杂交2小时。第二十五页，共三十七页，编辑于2023年，星期日加杂交液第二十六页，共三十七页，编辑于2023年，星期日盖上盒盖，插上卡子第二十七页，共三十七页，编辑于2023年，星期日放入恒温水浴中保温第二十八页，共三十七页，编辑于2023年，星期日第四部分实验步骤（4）清洗：洗液先预热至42℃。将芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗。依次在洗液Ⅰ、Ⅱ中各清洗4分钟。然后放在50ml锥形离心管中（标签纸端朝下），1500r/min离心1分钟以除去芯片表面的水分。（5）扫描及结果测定：启动微阵列芯片扫描仪系统，进行芯片扫描，保存检测结果。

第二十九页，共三十七页，编辑于2023年，星期日清洗甩干第三十页，共三十七页，编辑于2023年，星期日基因芯片扫描仪微阵列芯片扫描仪EcoScan－100第三十一页，共三十七页，编辑于2023年，星期日基因芯片扫描

仪工作原理第三十二页，共三十七页，编辑于2023年，星期日基因芯片扫描仪工作流程第三十三页，共三十七页，编辑于2023年，星期日软件界面按钮区状态栏图象显示区控制区第三十四页，共三十七页，编辑于2023年，星期日大肠杆菌的检测结果第三十五页，共三十七页，编辑于2023年，星期日黄单胞菌的检测结果第三十六页，共三十七页，编辑于2023年，星期日试剂（1）20×SSC：在800ml水中溶解175.3