其他zm屈铁军文章原始数据

序列完全一致（图形链球菌（S.mutans）UA159E.coliTop10及pMD-19T质粒同第一部分；载体pVA8912为红霉素抗性，全长约2.9kbmg/L（S.mutans司，；HindIII,SphI,PstI,HincII,SalI,HinfI,XbaI,BamHI,SmaI,KpnI,SacI,MCSMCS图 873bpGcp19-272氨基酸序列。F-SphI: 1.8变形链球菌gcp失活菌株的筛选及鉴P2:5΄GCGACTCCGTGCAGATAAAC3΄。PCR产物回收后用PstIgcp内部片段的克pMDT19/gcpF-SphI、R-EcoRIPCR扩增得到gcp编码区全长为873bp的内部序列。图

图 gcpPCR电泳1:PCR产物M:DNA

图 1:pVA8912/gcpSphI/2:pVA8912SphI/M:DNA杆菌中，但不能在链球菌中。采用SphI/EcoRI双酶切自pMD/gcp质中，构建gcp打靶载体pVA8912/gcp，酶切鉴定结果如图2.1.3。S.mutansUA159gcpmutant

图2.1.4通过同源重组构建gcp失活菌株的原理示意873bp的gcp内部片段克隆入SphI/EcoRI双酶切后的pVA8912质粒中，构建了gcp打靶载体pVA8912/gcp.转化S.mutans后,载体骨架通过同源重组插入S.mutans组中gcp内部，使gcp失活。S:SphI;E:EcoRI;P1,P2:鉴定用引物。Emr：红霉素抗性

以通过其上873bp的片段与S.mutans上的同源区域发生重组，从而整合到S.mutans上随之一起。重组后一方面将pVA8912/gcp上的红霉素抗性引入S.mutans的，使重组菌株产生对于红霉素的抗性;另一方面,pVA8912/gcp的插入打断了S.mutans上的gcp，产生由两个不完整的gcp结构构成的串联重复序列，其间被pVA8912的质粒骨架间隔，从而实现gcp的破坏。如图2.1.4所示，由于外源的插入，使得gcp被分割为两部分：在外源的上游是包括gcp的起始区域、信号肽编码区及约462bp的结构根据序列分析的结果这部分序列不能表达出GGDEF蛋白的功能区；在外源的下游是约2543bp的gcp结构序列，由于缺少了起始区，PstI酶切位点，为进一步的酶切鉴定提供了可能。为了进一步从分子水平筛选鉴定gcp失活突变株，本研究设计引物P1，P2扩增包括gcp起始码上游639bp至gcp终止码的片段，以野生型菌株组DNA为模板扩增出1913bp片段，而以突变菌株组为模板扩增得到5742bp片段，电泳结果与预期相符（图2.1.5a），证实了外源的插PCRPCRPstI单酶切，2.1.5bPCR产物可以切出四条带，比野生型菌多出3.8kb的条带，与预期结果相符。 图 gcp失活株的PCR鉴定和酶切鉴分别以野生菌和gcp失活菌组为模版，以P1～P2引物进PCR扩增的结果。M:DNAMarker，1:gbpD失活菌；2:P1～P2PstI酶切结果；M1:DL2000Marker,M2:λ-HindⅢDNAMarker生长曲线的测定UA159gcp5mLBHI10mg/LBHI37ºC24h200μL5mL新鲜的pH1.0pH5.0～7.0BHI液体培养基。取菌悬液pHpH值的能力，以pH的差值表示。1min，测OD600，以无菌生理盐水作为对照。生物膜形成量的测定UA159gcp37ºC预热的新鲜5g/LBHI200μL/1.7×105CFU/mL的菌200μL3min，使结合的细菌，倾去染色液后，再次用去离子水洗涤3次以洗去剩余575nm测定光密度值。。UA159gcp1:100（v/v）的比例接种入含件下培养48h取出釉质片，用无菌去离子水轻柔洗涤2次，置入戊二醛液中，4ºC固定24h。梯度脱水，冻干，喷金，扫描电镜观察。。I37（80%20%C210%224h600=1.01%BHI1:13748h23次上清液合并作为水溶性胞外0.5mol/LH3次，合并上清液，作为1.5ml34℃过0.1mol/LH620液绘制标准曲线，根据标准曲线计算二者合成的水溶性及水不溶性葡聚糖的含量，对两组进行比较。gcpSPSS10.0软件分析表明，两组数据无显著性差异(P=0.991)，说明gcp的失65gcpgcp321000.5 Incubation2.2.1UA159gcpUA159gcp失活菌株在不同pH条件下的产酸能力及耐酸能0.05，3210

gcpgcppH5pH5.5pH6pH6.52.2.2apH值条件下野生型和突变型变形链球菌产酸能力分析3210

gcpgcp pH5pH5.5pH6pH6.52.2.2bpH值条件下野生型和突变型变形链球菌耐酸能力分析962.2.3gcpOD值（0.40±0.10）显著低于野生菌（0.59±0.27表明gcp失活对变形链球菌UA159的生物膜形成有重要影响0

2.2.3UA159gcp（UA159野生菌相比，P50 2.2.4UA159gcp失活菌株水不溶性多糖的定量检测（UA159野生菌相比，P<0.01）48h2.2.4。在低倍视野下可见变形链球菌UA159野生菌在釉质表面的黏附量多于gcp失**黏附率黏附率0 gcp2.3.1UA159gcp失活菌对唾液包被的羟基磷灰石表面的黏附率（*UA159野生菌相比，P<0.01）

2.2.4UA159gcp失活菌在玻璃、釉质表面形成生物膜的扫描电镜(a),(b):UA159生物膜；(c),(d):gcp失活菌在玻璃表面的生物膜(e),(f):gcp失活菌在釉质表面的生物膜C 2.3.3UA159gcp失活菌对唾液包被羟基磷灰石变形链球菌gcp在大肠杆菌中的表pPROEXHTb-gcp1.2.2.1线性化双粘末端pPROEXHTb载体，酶切反应体系：纯化的pPROEXHTb质粒 17µL10×K 2 0.5 0.537ºC酶切4h后，10g/L1.2.2.2线性化双粘末端gcp片段，酶切反应体系：纯化的pMD19T-gcp质粒 43µL10×K 5 1 1在实验一中，为了快速鉴定gcp序列，pMD19T-simple/gcp质粒未引入酶切位点，故本实验中引入酶切位点后连接至表达载体并。线性化双粘末端pPROEXHTb载体片段4线性化双粘末端gcp片 11Ligation 5混匀后16ºC连接30min连接产物热转化至E.coliDH5α感受态细胞（方法同实验一）转化菌培养14-16h后，从Amp+的LB平板上随机挑取阳性菌落，分别接种于Amp+的LB培养液，37ºC震荡培养过夜。分别取菌液各500μL，12000r/min离minmin12000mol/L，TritonX-10050mL/L为pPROEXHTb-gcp。pPROEXHTb-gcpml，加适量去离子水混匀，定溶至50ml，1.5mlEP管分装，-20℃保存。5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：每100mL94g，100g/LSDS50mL，Tris碱15.1g。45mL45mL，冰醋酸10mL考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-2500.25g，溶于100ml甲醇/醋酸脱色液中，Whatmal1号滤纸过滤。电转移缓冲液：甘氨酸2.9g，Tris碱5.8g，SDS0.37g，甲醇200ml，去离子水定溶至1000ml。封闭液（BlokingBuffer）：TBS+5%脱脂奶粉（w/v）丽春红染液：丽春红s2g，三氯乙酸30g，璜基水杨酸30g，加去离子水至 mmol/L，PMSF1mmol/L。10%分离 5%浓缩去离子 1.9 1.4300g/L丙烯酰 1.7 0.33 1.3(1.5mol/L,

0.25(0.5mol/L,100g/L100g/L将pPROEXHTb-gcp质粒及空载体pPROEXHTb分别转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布Amp+的LB琼脂平板。37ºC倒置培养16h出现菌落。随机挑取单菌落接种于5mL、Amp+的LB培养液中，37ºC振荡培养过夜（120-150r/min）。取100μL过夜菌转接种于10mLAmp+的LB培养液中，37ºC振荡培养至OD600达0.6-0.8。每管中各取菌液1mL，室温离心5000r/min5min，弃上清，沉淀中加入1×上样缓冲液200μL，煮沸5min，离心12000r/min5min，取上清作为未诱导样本，-20ºC保存备用。剩余菌中加IPTG诱导剂,使终浓度分别为1mmolL和0.1mmol/L，37ºC继续振荡培养4h，分别于加入IPTG后2、4h各取1mL菌液，将所取菌液同上述方法处理。将诱导前和诱导后不同时间的样本进行按同样方法,取20mLIPTG诱导培养4h的菌液，4ºC离心10000r/min5min收菌，湿菌称重，按照10mL/g加入超声裂解缓冲液重悬细菌，在冰浴下超声裂菌，4ºC离心，10000r/min10min，上清加入2上样缓冲液，沉淀中加入1上样缓冲液，SDS蛋白凝胶电泳。1.2.2.3使用bandscanversion5.0（Glyko，USA）软件分析SDS图 pPROEXHTb-gcp质粒构建示意重组质粒pMD19T-gcp用BamHI/SalI双酶切，回收目的片段，定向插入BamHI/SalI酶切后的原核表达载体pPROEXHTb中，构建重组融合表达质粒1.2.11.2.2b）；以该重组质粒为模板扩增出约2.0kb的单一条带（图1.2.2a）。以上结

PCR鉴定MDL2000Marker1：PCR产物

M1:λ-HindⅢDNAMarkerM2:DNAMarkerDL2,0001:pProEXHTb-BamHI/SalI2:pProEX-gcp-图 pPROEXHTb-gcp重组质PCR图1.2.2.5pPROEXHTb-gcp质粒中gcpRV-M结将鉴定为阳性的重组质粒及空载体分别转化至DH5α感受态细胞中,涂布Amp+的LB琼脂平板。37ºC倒置培养过夜,在相对分子量为77KDa处出现一条新生的蛋，与预计的融合蛋白大小相符使用b