microRNA解读教学讲解课件

2023/6/4非编码RNA真核生物中存在两种主要的非编码RNA(non-codingRNA),在真核生物中发挥重要作用：一类为微小RNA(microRNA,miRNA),另一为小干扰RNA(siRNA)。miRNA大小为19~25nt,在体内与蛋白质形成核糖核蛋白复合体(miRNP),在真核基因的表达调控、生长发育中起重要作用。siRNA在RNA干扰(RNAinterference,RNAi)途径中起定位特异mRNA的作用。编码蛋白的基因2023/6/4非编码RNA的基因2%20%60%98%98%人果蝇线虫结核杆菌

表观遗传学的主要机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰及新近发现的非编码RNA。

非编码RNA：是指不能翻译为蛋白的功能性RNA分子。看家非编码RNA：tRNA,rRNA调控非编码RNA：长链非编码RNA

（lncRNA）

短链非编码RNA（siRNA、miRNA、piRNA）

Non-codingRNA

非编码RNA的功能

1.影响染色体的结构

2.调控转录

3.参与mRNA选择性剪接

4.参与mRNA的稳定和翻译调控过程

5.影响蛋白质的稳定和转运

近年来大量研究表明非编码RNA在表观遗传学修饰中扮演了重要的角色,能在基因组水平及染色体水平对基因表达进行调控,决定细胞分化的命运。非编码RNA在表观遗传学中的作用lncRNA（Longnon-codingRNA）转录本长度超过200nt的长链非编码RNA分子；可在多个层面（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达；分类:正义(Sense)lncRNA反义(Antisense)lncRNA双向(Bidirectional)lncRNA基因内(Intronic)lncRNA基因间(Intergenic)lncRNAlncRNA位于细胞核内或胞浆内；参与X染色体沉默、染色体修饰和基因组修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等过程；1.编码蛋白的基因上游启动子区转录，干扰下游基因的表达；2.抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因的表达；3.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；5.与特定蛋白质结合，lncRNA转录本可调节相应蛋白的活性；6.作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；7.结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定位；8.作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子。1.编码蛋白的基因上游启动子区转录，干扰下游基因的表达；2.抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因的表达；3.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；5.与特定蛋白质结合，lncRNA转录本可调节相应蛋白的活性；6.作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；7.结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定位；8.作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子。1.编码蛋白的基因上游启动子区转录，干扰下游基因的表达；2.抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因的表达；3.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；4.与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；5.与特定蛋白质结合，lncRNA转录本可调节相应蛋白的活性；6.作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；7.结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定位；8.作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子。siRNA

siRNA:是一类外源性的双链小分子RNA，它的长度一般为21~25nt。它在RNA干扰途径中通过引导目的基因mRNA的降解，以抑制mRNA的表达。siRNA也可经由多种不同转染（transfection）技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的基因敲除（knockdown）效果，这使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。SmallinterferingRNAs(siRNAs).AclassofdoublestrandedRNAs(dsRNAs)of~21nucleotidesinlength.siRNAsareproducedfromlongerdouble-stranded(bimolecular)RNAsorlonghairpins,oftenofexogenousorigin,andusuallytargethomologoussequencesatthesamelocusorelsewhereinthegenomefordestruction(genesilencing),thephenomenontermedRNAi.However,thedistinctionbetweenmiRNAsandsiRNAsisbecomingblurredasbothareproducedbysimilarpathwaysandhavesimilarmechanismsofaction.

siRNAmiRNA

概念：miRNA是长约21∼25nt的单链RNA,其中50%定位于易发生结构改变的染色体区域。特点：miRNA是内源性的,是生物体基因的表达产物;miRNA是由不完整的发卡状双链RNA,经Drosha和Dicer酶加工而成。

miRNA最开始的形成是源于内源性的生物体基因产生的发卡结构,该发卡结构在细胞核内经Drosha-DGCR8复合物加工产生pre-miRNA。然后pre-miRNA进入细胞质，进一步由Dicer酶切形成miRNA-miRNA二聚体，最后装载至Argonaute蛋白1(AGO1)而发挥作用。目前研究表明:哺乳动物细胞内miRNA的调控机制反映了miRNA的特异装载蛋白AGO以及miRNA与mRNA之间的互补程度；

miRNA可通过调控组蛋白修饰引起染色质重塑；

miRNA可通过调控DNA甲基化酶的表达而影响DNA甲基化。piRNApiRNA是近年来在哺乳动物细胞内发现的长度约为24∼31nt的RNA分子,因在生理状态下能与piwi蛋白偶联,故命名piRNA。由于Piwi为一表观遗传学调控因子,能与PcG蛋白共同结合于基因组PcG应答元件上,协助PcG沉默同源异型基因,因此推测与Piwi相关的piRNA也应具有表观遗传学的调控作用

piRNA的形成及扩增piRNA前体与piwi蛋白结合后，能在u位点进行切割形成piRNA反义链，piRNA反义链能与转座子识别，并使切割后的转座子与AGO3蛋白结合，从而进一步对转座子进行修饰切割，切割后的转座子可以与piRNA前体结合，并且在U位点切割前体，从而使切割后的前体与piwi蛋白结合，进过剪切修饰形成PiRNA和PiRNA与Piwi蛋白结合的复合体，从而使PiRNA数量增多。非编码RNA的比较种类长度（nt）来源主要功能siRNA~21~25

长双链RNA转录基因沉默miRNA~21~25

含发卡结构的pri-miRNA转录基因沉默piRNA~24~31

长单链前体或起始转录产物等多途径生殖细胞内转座子的沉默lncRNA>200

多种途径基因组印记和X染色体失活结语：

非编码RNA是生物体内一个重要的调控分子家族，有人提出了“RNA世界”的概念。但是，迄今为止，对非编码RNA的研究仍然是初步的，大部分功能尚未探明，主要原因是至今对它们在基因调控方面的作用还不清楚，同时非编码RNA在细胞中是低丰度存在的，不易被检测到。近来的一些研究显示，非编码RNA在转录产生的一些复合物中占有很大的比例，使人们意识到它们是重要的、有潜力的调控分子。我们相信对非编码RNA的研究将日益受到重视，对其研究也将越来越深入，有更多种类的非编码RNA分子将被发现，其功能也将逐步被阐明，非编码RNA也必将在医药等实践中得到广泛的应用。2023/6/4细胞内基因表达调控的新途径

----miRNA介导的基因沉默miRNA的发现miRNA的作用机制miRNA的应用领域miRNA研究的技术路线2023/6/41993年，VictorAmbros小组以线虫为对象，用基因打靶技术研究某些基因对其发育的影响。他们找到了一个对发育有明显干扰的基因lin-4。通常线虫要通过四个幼虫阶段才能成熟，lin-4基因的突变使其只停留在第一阶段。。miRNA的发现microRNApioneer2023/6/4令人惊奇的是，他们发现

lin-4并非编码一种调控蛋白，而编码小RNA分子：22nt和61nt；序列分析显示，22nt的小RNA分子是66nt（颈环结构的5’臂部分）的一部分。Ambros和GaryRuvkun(Harvard)又进一步发现，22nt的lin-4能部分的和LIN-14mRNA的3’UTR互补结合，所以他们推测，lin-4以类似反义RNA的作用机制通过与lin-14mRNA结合而下调LIN-14蛋白的表达。miRNA的发现LeeRC,FeinbaumRL,AmbrosV.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell,1993,75(5):843—8542023/6/4Specifically,lin-4wasresponsiblefortheprogressiverepressionoftheproteinLIN-14duringlarvaldevelopmentoftheworm;mutantwormsdeficientinlin-4functionhadpersistentlyhighlevelsofLIN-14anddisplayeddevelopmentaltimingdefects.

在线虫发育阶段，Lin-4负责连续抑制LIN-14蛋白的表达在lin-4基因突变的线虫中，LIN-14蛋白的浓度持续偏高，导致了线虫的发育停留在第一阶段。miRNA的发现2023/6/4In2000,anotherC.eleganssmallRNAregulatorymolecule,let-7,wascharacterizedbytheRuvkunlabandfoundtobeconservedinmanyspecies,includingvertebrates.ThesediscoveriesconfirmedthatAmbroshadinfactdiscoveredaclassofsmallRNAswithconservedsequenceandfunctions.ThesemoleculesarenowknownasmicroRNA.

miRNA的发现ReinhartBJ,SlackFJ,BassonM,etal.The21-nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans.Nature,2000,403(6772):901—906PasquinelliAE,ReinhartBJ,SlackF,etal.Conservationofthesequenceandtemporalexpressionoflet-7heterochronicregulatoryRNA.Nature,2000,408(6808):86—89NorthernblotS1核酸酶作图2023/6/4miRNA的特征长度一般为19－25nt，是内源性、非编码、小分子单链RNA。一般来源于染色体非编码蛋白区的一段；能通过与靶基因mRNA的侧翼区域特异性配对结合，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译，广泛地负调控靶基因的表达。广泛存在于在果蝇、软体动物、鱼类以及人等真核生物中。目前,人类已经发现400余种miRNA，可以调控人体中1/3基因的表达水平。部分miRNA基因以基因簇形式存在于基因组中，它们多以顺反子的形式转录出前体转录本，再由Dicer切割前体的双链部分而生成；相当一部分miRNA位于基因的内含子区域；植物的miRNA前体比动物的长约3倍；miRNA在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性。2023/6/4miRNA的产生和功能在细胞核内转录成前体转录本被RNaseIII核酸酶Drosha加工成约70-90nt的发夹状pre-miRNA转运到细胞质被DICER加工成成熟的miRNA双链miRNA分子被解链，单链的miRNA进入一个核糖蛋白复合体miRNP(RISC)通过与靶基因的3’UTR区互补配对，指导miRNP复合体对靶基因mRNA进行切割或者翻译抑制。miRNA基因序列pri-miRNApre-miRNADrosha成熟miRNADicer转录pre-miRNA细胞核出核细胞质2023/6/42023/6/4miRNA与siRNA的区别miRNAsiRNA单双链单链双链前体70nt的ssRNA,茎-环结构dsRNA作用部位靶mRNA的3’-UTR靶mRNA与靶序列配对不完全，最多配对8nt完全配对2023/6/4Dicer是一种RNaseⅢ类核酸酶,RNaseⅢ酶的产物的特征是3′羟基和5′磷酸的核苷酸片段；miRNA并不是DICER生成的惟一产物,siRNA也是由Dicer剪切dsRNA而产生的。Dicer反应生成miRNA和siRNA都需要ATP参与，在Dicer的氨基端有一个ATP依赖的螺旋酶结构域。线虫中，dcr-1（dicer）的突变体由于不能正确加工miRNA前体，生成成熟的miRNA，突变体始终在进行类似干细胞那样的不断分裂，而不进入下一个发育阶段。2023/6/4miRNA序列的保守性成熟miRNAs22个碱基中5′端的第2到8个核苷酸被称为核心序列,它与靶基因序列的3′端UTR有很高的互补性。2----------82023/6/4miRNA的作用机制完全互补mRNA剪切降解不完全互补mRNA的翻译受阻2023/6/4miRNA的调控特点交叉调节：动物miRNA与靶mRNA之间的不完全配对使得任何一个miRNA都可能作用于不同的mRNA，一个mRNA也可能受到多个不同miRNA的调节。自我调节：自我调节参与了miRNA的生物合成和功能。例如，参与miRNA生物合成的一些酶也受到其他产物miRNA的调节。Dcl1mRNA编码一种植物Dicer蛋白，参与miRNA的生成，同时它也是miR2162的靶分子。可逆性调节：miRNA所致的翻译抑制在某些条件下是可逆的。当mRNA作为miRNA抑制的靶分子后，mRNA会被送至胞浆内的P体（Pbodies）重新定位。2023/6/4miRNA调节方式的优点与蛋白水平的调节相比，更加节省能量；与转录水平的调节相比，miRNA调节更迅速，而且是可逆的；内含子所编码的miRNA是一种对基因组资源的高效利用。2023/6/4microRNA基因组分布60%独立表达15%成簇表达25%的miRNAs位于内含子2023/6/4植物与动物miRNA的区别动物植物前体茎环结构短，简单长，复杂，折回长度变异明显加工过程先在细胞核，后在细胞质仅在细胞核中作用机制大部分作为翻译阻遏子，小部分导致靶mRNAs降解大部分介导靶mRNAs的降解长度22-23nt21nt保守性高更高2023/6/4miRNP与RISC都是一种核糖核蛋白（RNP）;二者的大小相近,miRNP约550kDa,RISC约500kDa;都含有PPD蛋白(人的miRNP含有EIF2C2，是一种PPD蛋白，果蝇的RISC中也含有PPD蛋白AGO-2)。PPD蛋白：具有PAZ和PiWi两个结构域的蛋白。2023/6/4应用领域疾病治疗miRNA干细胞研究病毒研究肿瘤研究植物研究动物研究2023/6/4microRNA与肿瘤研究肿瘤发生：miRNA能作为肿瘤抑制剂或致癌因子行使功能，特定miRNA的敲除或过表达可用于研究miRNA在癌症发生和发展过程中的作用；近年发现50％以上的miRNA基因定位于肿瘤相关的染色体座位或其脆性位点，直接或间接导致了肿瘤的发生。肿瘤诊断：正常组织和肿瘤组织中miRNA表达明显改变，这些特点使miRNA有可能成为肿瘤诊断的新的生物学标记和治疗药物作用的靶标；慢性淋巴细胞白血病(CLL)中miR-15a和miR-16-1存在缺失或下调。癌旁组织相比，癌肿组织的miR一122表达是下降的。肿瘤治疗：由于大多数致癌基因能够引发癌症，因而可以设计一些人造miRNA阻碍其表达，从而达到抑制癌症形成的目的。体外实验表明，let-7对多种人类肺癌组织有明显抑制作用，移植到小鼠肺癌模型中，let-7作为鼻内药物能减少小鼠肺癌模型的肿瘤形成。2023/6/4miRNA与干细胞研究miRNAs在干细胞的自我更新、未分化状态的维持、继续分化增殖都有重要的调控作用。将miRNAs作用与转录因子调控和表观遗传调控等相结合，有助于全面了解干细胞自我更新和多向分化潜能的分子机制。2023/6/4miRNA与病毒研究miRNAs可以通过与病毒的靶mRNA结合，从而灭活RNA病毒；宿主细胞编码miRNA对