微生物的计数及分离纯化

微生物的计数及分离纯化第一页，共五十九页，编辑于2023年，星期六微生物的计数

一、目的要求1、了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。2、学习平板菌落计数的基本原理和方法

第二页，共五十九页，编辑于2023年，星期六二、实验原理

测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和平板计数法。

显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（PetrofHausser）细菌计数板。第三页，共五十九页，编辑于2023年，星期六认识显微镜第四页，共五十九页，编辑于2023年，星期六第五页，共五十九页，编辑于2023年，星期六镜筒：单筒：直立式（长度为160mm）、后倾式（倾斜45°）双筒：倾斜式转换器：3~5个孔载物台：方形、圆形

中央有一通光孔，孔的两侧装有标本夹，还有移动器（其上有刻度标尺）调节器（粗、细）：

镜壁上：升降镜壁调焦镜壁下：升降载物台调焦第六页，共五十九页，编辑于2023年，星期六第七页，共五十九页，编辑于2023年，星期六显微镜的使用方法步骤：1、取镜和安放2、对光3、观察4、整理与存放第八页，共五十九页，编辑于2023年，星期六右手握住镜壁，左手托住镜座把显微镜放在实验台边缘5厘米左右处，略偏左，安装好目镜取镜和安放第九页，共五十九页，编辑于2023年，星期六对光转动转换器，使用低倍物镜对准光孔（注意不要用手扳物镜！！！）第十页，共五十九页，编辑于2023年，星期六观察把所要观察的玻片标本放在载物台上，用夹片夹住，标本要正对通光孔第十一页，共五十九页，编辑于2023年，星期六转动粗准焦螺旋，顺时针旋转，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（物镜尖端距载玻片约0.5cm）第十二页，共五十九页，编辑于2023年，星期六左眼向目镜内看，同时逆时针转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直到看清物象为止。再略微转动细准焦螺旋，使看到的物象更加清晰第十三页，共五十九页，编辑于2023年，星期六如果粗准焦螺旋调节旋钮旋得太快，超过焦点，需要将粗准焦螺旋调到最低，重新寻找焦点观察时双眼睁开（不疲劳），若是单筒显微镜也用左眼观察，便于绘图。第十四页，共五十九页，编辑于2023年，星期六高倍镜的操作1、先用低倍镜找到目的物并移至视野中央；2、转动转换器，换至高倍镜；3、观察目的物，同时微微上下转动细准焦螺旋，直到视野内看到清晰的目的物为止。第十五页，共五十九页，编辑于2023年，星期六

油镜的操作

1、先按低倍镜到高倍镜的操作步骤找到目的物，并将目的物移到视野中央；2、在载玻片上滴一滴香柏油（或液体石蜡），将油镜移至正中使镜面浸没在油中，刚好贴近载玻片。一般情况下，转过油镜即可看到目的物，如果不够清晰，回调节细准焦螺旋，即可看清目的物。3、观察完毕，用擦镜纸将镜头的油揩干净，另外用擦镜纸蘸少许二甲苯揩拭镜头，再用擦镜纸揩干。第十六页，共五十九页，编辑于2023年，星期六整理与安放1、观察完毕，先提升镜筒，取下玻片标本2、用纱布把显微镜表面擦干3、转动转换器，使两个物镜伸向前方，将镜筒缓缓降至最低4、将反光镜放在直立的位置5、将显微镜放回原处第十七页，共五十九页，编辑于2023年，星期六使用注意事项左手拖镜座，右手握镜臂。轻拿轻放。放置：靠光源，靠体前略偏左、镜筒在前，镜臂在后。

让低倍物镜正对通光孔。转遮光器，让较大的光圈对准通光孔。第十八页，共五十九页，编辑于2023年，星期六血球计数板

是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。第十九页，共五十九页，编辑于2023年，星期六血球计数板第二十页，共五十九页，编辑于2023年，星期六

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每mL菌液（或每g样品）中微生物细胞的数量。计数公式

1、16格×25格的血球计数板计算公式：

细胞数/ml=100小格内细胞个数÷100×400×10000×稀释倍数

2、25格×16格的血球计数板计算公式：

细胞/ml=80小格内细胞个数÷80×400×10000×稀释倍数计算方法第二十一页，共五十九页，编辑于2023年，星期六平板计数法平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。第二十二页，共五十九页，编辑于2023年，星期六三、实验器皿与材料血球计数板计数：显微镜、血球计数板、移液管、酵母菌液（或其他微生物材料）、盖玻片、擦镜纸、吸水纸

平板计数：1．菌种大肠杆菌菌悬液。2．培养基牛肉膏蛋白陈培养基。3．仪器或其他用具1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。第二十三页，共五十九页，编辑于2023年，星期六四、实验步骤1、细胞计数(1)稀释：将样品稀释至适合的浓度（本实验用的是酵母菌），一般将样品稀释至每一格约有4-5个细胞数为宜。2、加被测样品（菌液）至血球计数板：去洗净的血球计数板，将盖玻片盖住中间的计数室，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。血球计数板计数第二十四页，共五十九页，编辑于2023年，星期六3、静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。4、计数时若计数区是通常采用五点记数法。第二十五页，共五十九页，编辑于2023年，星期六5、对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2-3次，求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。6、

测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。第二十六页，共五十九页，编辑于2023年，星期六第二十七页，共五十九页，编辑于2023年，星期六注意事项稀释样品时应使用无菌水避免污染菌液。盖载玻片时勿使产生气泡。在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。每个样品重复计数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作）第二十八页，共五十九页，编辑于2023年，星期六实验步骤平板计数法l．编号2．稀释3．取样4．倒平板5．计数

第二十九页，共五十九页，编辑于2023年，星期六计数培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算。每毫升中菌落形成单位=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数第三十页，共五十九页，编辑于2023年，星期六注意一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。第三十一页，共五十九页，编辑于2023年，星期六注意板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。第三十二页，共五十九页，编辑于2023年，星期六微生物的分离纯化第三十三页，共五十九页，编辑于2023年，星期六一、实验目的1

了解划线分离菌种的原理并掌握操作方法2

掌握微生物斜面接种培养的方法和微生物无菌操作计数第三十四页，共五十九页，编辑于2023年，星期六二、实验原理1、平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法，一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面做多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落（通常认为这种单菌落就是某个微生物的“纯种”）

2、平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。第三十五页，共五十九页，编辑于2023年，星期六倒平板→制备梯度稀释液→划线法（或涂布法）→培养→挑单菌落→保存。基本路线第三十六页，共五十九页，编辑于2023年，星期六三、仪器与材料1、

菌种：大肠埃希氏菌(Escherichia

coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus

subtilis)的混合培养斜面菌种。2、培养基：伊红美蓝琼脂培养基。3、器皿：无菌培养皿，水浴锅，接种环，培养箱等第三十七页，共五十九页，编辑于2023年，星期六四、实验步骤

1、融化培养基将装有伊红美蓝琼脂培养基的三角瓶放入热水浴中加热至沸，直至充分融化。2、倒平板待培养基冷却至50℃左右后，按无菌操作法倒平板(每皿约倒15ml)，平置，待凝。第三十八页，共五十九页，编辑于2023年，星期六操作方法：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用右手手掌和小指将瓶塞轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一条稍大于瓶口的缝隙，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。第三十九页，共五十九页，编辑于2023年，星期六3、做分标志区

在皿底用记号划分成4个不同面积的区域，使A<B<C<D，且各区的夹角应为120°左右，以便使D区与A区所划出的线条相平行、美观。（如图）第四十页，共五十九页，编辑于2023年，星期六4、划线操作1)挑取菌样：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。

2)先划A区：将平板倒置于酒精灯火焰旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并让平板面向火焰。右手持含菌的接种环，先在A区轻巧地划3~4条连续的平行线当作初步稀释的菌源。烧去接种环上的残余菌样。第四十一页，共五十九页，编辑于2023年，星期六

3)划其余区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转至划线位置，把接种环通过A区(菌源区)而移至B区，随即在B区轻巧地划上6~7条致密的平行线，接着再以同样的操作在C区和D区划上更多的平行线，并使D区的线条与A区平行(但不能与A区或B区的线条接触！)，最后，将左手所持皿底放回皿盖中。烧去接种环上的残菌。

5、恒温培养将划线后的平板至37℃倒置培养2~3天6、挑单菌落良好的结果应在C区出现部分单菌落，而在D区出现较多独立分布的单菌落第四十二页，共五十九页，编辑于2023年，星期六7、然后从典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面，经培养后即为初步分离的纯种。然后从典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面，经培养后即为初步分离的纯种。8、清洗培养皿将废弃的带菌平板作煮沸杀菌后进行清洗、晾干。9、保存菌种。第四十三页，共五十九页，编辑于2023年，星期六斜面接种斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一支新鲜斜面。一。实验步骤：(1)贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2-3cm的位置。(2)点燃酒精灯。

(3)接种用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。第四十四页，共五十九页，编辑于2023年，星期六接种的步骤

1)手持试管将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置，如图。

2)旋松管塞先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。

3)取接种环右手拿接种环(如握钢笔一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。第四十五页，共五十九页，编辑于2023年，星期六4)拔管塞用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。见图所示。接种的步骤第四十六页，共五十九页，编辑于2023年，星期六

5)接种环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。

6)取菌待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。接种的步骤第四十七页，共五十九页，编辑于2023年，星期六

7)接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。接种的步骤第四十八页，共五十九页，编辑于2023年，星期六接种的步骤8)塞管塞，取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。塞棉塞时不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。

9)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。注：尽量选择独立的单菌落进行斜面接种，经过培养后即得到纯菌种斜面。只经一次划线，若有菌种不纯，则进行第二次或者数次划线后得到纯菌种。第四十九页，共五十九页，编辑于2023年，星期六操作图第五十页，共五十九页，编辑于2023年，星期六五、注意事项1、为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。2、用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。3、用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。4、为了取得良好的划线效果，可事先用圆纸垫在空培养皿内画上4区，并用接种环练习划线动作，待通过模拟试验熟练操作和掌握划线要领后，再正式进行平板划线。第五十一页，共五十九页，编辑于2023年，星期六菌种的保藏1、低温定期移植保藏法。2、液体石蜡保藏法。3、沙土管保藏法。4、滤纸片保藏法。5、自然基质保藏法6、生理盐水保藏法。7、液氮超低温保藏法。第五十二页，共五十九页，编辑于2023年，星期六低温定期移植保藏法

适用范围：适用于大多数的细菌和真菌。除草菇菌种外，其他食用菌菌种都能采用此法保藏。将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3-5℃低温干燥处或4℃冰箱、冰柜中保藏，每隔4-6个月时间移植转管一次，具体应根据菌种特性决定。保藏时要注意环境温度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。因此，若用棉塞，可用干净的硫酸纸或牛皮纸包扎棉塞，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。

第五十三页，共五十九页，编辑于2023年，星期六方法与步骤培养基制备器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，根据不同情况洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量。第五十四页，共五十九页，编辑于2023年，星期六方法与步骤调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸或稀碱调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。第五十五页，共五十九页，编辑于2023年，星期六方法与步骤过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装，斜面培养基不宜超过试管高度的四分之一。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿