现代分离技术第二章

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什么是色谱方法(Chtomatography)?

最初，1903年，M.C.Цвег把干燥的叶子用石油醚萃取后，将小量的萃取液倾入充填有沉降碳酸钙的玻璃柱子的顶端，然后用石油醚淋洗，结果叶中的色素在碳酸钙柱上互相分离，形成不同颜色的色带，分列在柱上；随着淋洗液的流动，色带的分离越加明显。他把这种方法叫做“色谱法”，色谱的英文名称是chromatograph，它是由希腊文chromos和grapho两字并合而成，字面上意义是颜色的记录。

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可以说茨维特在色谱方面做了开创性的工作，但以后的二十几年并未引起很多人的注意，直到1931年有人用充填氧化铝粉末的柱管将性质非常相似的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素分离成功（在此之前，人们一直以为胡萝卜素是一种纯物质），并且得到的纯物质可做Ｃ、Ｈ元素定量分析用，这才引起了许多有机化学工作者的注意，认识到色谱法在分离混合物方面有广阔的前景，并且研究出许多新技术，例如分配色谱法、纸上色谱法、薄层色谱法、离子交换色谱法等。当前第5页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

现在，人们所说的“色谱”一词的含义已经远不是茨维特所发现的那种色带，而是根据混合物中各组分在互不相溶的两相(固定相、流动相)中的吸附能力、分配系数或其它亲合能力的差异而设计的分离分析方法，它集分离与分析于一体，快速、简便、微量，成为分离分析复杂混合物的理想方法之一。现在，色谱法所涉及到的领域不仅限于分析化学，而且涉及到许多其它领域如石油化工、精细化工、近代电子技术、生命科学、食品科学、临床分析、考古学、甚至兴奋剂检测等。当前第6页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

虽然目前在各种色谱法中茨维特所发现的那种色带已经没有普遍性，但由于这种名称在中外已沿用很久，众所周知，不宜更改。因此国家标准中仍定名为色谱法。当前第7页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

色谱分离法的种类很多，根据流动相和固定相的特点，可以分为：柱色谱（ＣＣcolumuchro.）薄层色谱（ＴＬＣthinlayerchro.）纸色谱（ＰＣpaperchro.）气相色谱（ＧＣgaschro.）高效液相色谱（ＨＰＬＣhighperformanceliquidchro.）凝胶渗透色谱（ＧＰＣgelpermeationchro.）离子交换色谱（ＩＥＣironexchangchro.）

…………

这里我们主要介绍ＴＬＣ、ＧＣ、ＨＰＬＣ。当前第8页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

一、简介ＴＬＣ──在铺成薄层的固体上进行色谱的方法。（简述ＴＬＣ的操作及仪器）当前第9页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

优点：①操作容易，设备简单，易于掌握。②分离迅速（ＰＣ需几个小时到几十个小时，ＴＬＣ只需十几分钟到几十分钟）。③灵敏度高（可检测10-5μg物质）。④固定相（与ＰＣ相比）、流动相（与ＧＣ相比）、显色剂(与PC相比）均可灵活选用。当前第10页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

优点：⑤样品用量可小（几微克～几十微克）可大（几毫克～几百毫克），可用于备色谱。⑥特别适用于热不稳定及难挥发样品。⑦技术多样化（如双向展开、多次展开等），可分离复杂样品。⑧不存在样品堵塞柱子而使柱效下降或柱子报废的问题。当前第11页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

缺点：①不适合挥发性样品、②自动化程度低于ＧＣ、ＨＰＬＣ。③分离效果不及ＧＣ、ＨＰＬＣ，不能分离过于复杂的样品。当前第12页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

二、基本原理1.TLC分类按照分离过程中样品与固定相、流动相之间相互作用的性质，有三种TLC：①吸附色谱：②分配色谱：③离子交换色谱：当前第13页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

①吸附色谱：利用样品中各组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，将其分离。Ｒf值大──溶质对吸附剂的吸附能力小。Ｒf值小──溶质对吸附剂的吸附能力大。当前第14页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

②分配色谱：利用样品中各组分对固定液与流动相的分配系数不同，将其分离，原则上与液－液连续萃取相似。Ｒf值大──溶质易溶于流动相，不易溶于固定相。Ｒf值小──溶质易溶于固定相，不易溶于流动相。当前第15页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

③离子交换色谱：样品中某组分与离子交换剂进行离子交换作用。这里主要介绍吸附色谱。当前第16页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

2.吸附色谱原理二、基本原理

吸附色谱的原理是基于样品溶液与固定相表面发生了吸附作用。吸附有物理吸附和化学吸附之分，物理吸附的特点是无选择性、吸附速度快、可逆、吸附热小，化学吸附的特点是有选择性、吸附速度慢、不可逆、吸附热大。在吸附色谱中主要发生物理吸附。当前第17页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

在吸附剂固体表面，溶质分子（Ａ）与溶剂分子（Ｓ）以占据吸附剂表面的位置可以互相竞争，Ａ可以顶出Ｓ，Ｓ也可以顶出Ａ，这种竞争可用下式表示：Ａ溶＋Ｓ吸＝＝Ａ吸＋nＳ溶

Ａ溶──溶液中的溶质分子；Ａ吸──被吸在吸附剂表面的溶质分子；Ｓ溶──溶液中的溶剂分子；Ｓ吸──被吸在吸附剂表面的溶剂分子；

n──竞争过程中，被溶质分子顶出来的溶剂分子的个数（假定溶质分子体积比溶剂分子大）。当前第18页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

溶质分子顶替溶剂分子时，过程从左向右进行；溶剂分子顶替溶质分子时，过程从右向左进行；一定条件下（如Ａ、Ｓ、吸附剂、Ｔ、Ｐ、…

…），这种竞争达到平衡，即Ａ、Ｓ的吸附或解吸速度相等。但条件改变时，平衡就会遭到破坏，如果向上述平衡体系中加入溶剂，平衡就会向左移动，然后达到新的平衡。当前第19页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

在吸附薄层色谱中，展开剂(溶剂)是不断供给的。所以，原点上Ａ与Ｓ（展开剂）之间的平衡不断遭到破坏，吸附在原点上的溶质不断解吸，解吸出来的Ａ溶于Ｓ中并随之向前移动，遇到新的吸附剂表面，Ａ与Ｓ又建立起新的平衡，但又立刻遭到不断移动上来的展开剂（Ｓ）的破坏，又有一部分Ａ解吸并随之向前移动。如此吸附－解吸附－再吸附－再解吸附－再吸附－……的交替过程就构成了色谱法的分离基础。当前第20页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

吸附力弱的组分容易解吸而溶于展开剂中，并随之向前移动，Rf值较大；吸附力强的组分不易解吸，也不易随着展开剂向前移动，Ｒf值较小；如果样品溶液中有两种溶质Ａ1、Ａ2，其极性不同，因而其吸附能力、Rf值也就不同，从而达到分离。当前第21页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

3.吸附作用强弱顺序二、基本原理如何判断各种溶质分子在吸附剂表面吸附能力的大小？当然是考虑吸附剂与溶质分子间作用力的大小。

吸附色谱常用的吸附剂为：氧化铝、硅胶根据活性分为五个级，一级活性最高，五级最低。当前第22页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

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聚酰胺：─C-NH-(CH2)5─吸附剂的共同特点是：①含有带孤对电子的氧原子、氯原子。②含有-NH-、-OH-等,易形成氢键。即极性大，易成氢键。当前第23页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

吸附剂与非极性溶质分子间的作用力主要是诱导力；吸附剂与极性溶质分子间的作用力主要是静电力。（静电力＞诱导力）所以，溶质的极性越大，与吸附剂的作用力越大，即极性大的样品与固定相的亲合力大。当前第24页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

所以，吸附剂与被吸附物质间的亲合作用遵循下列原则：①被吸附物质的极性越大，与极性吸附剂的作用越强，单官能团化合物与硅胶或氧化铝有下列亲合顺序：羧酸＞醇、酰胺＞伯胺＞酯、醛、酮＞腈、叔胺、硝基化合物＞醚＞烯＞卤烷＞烷烃②分子中双键数目越多，亲合力越大；③分子中苯环数目越多，亲合力越大；④分子中官能团数目越多，亲合力越大；（有例外：邻硝基苯酚与硅胶、氧化铝的亲合力＜苯酚或硝基苯）⑤被吸附物质的分子量越大，亲合力越大（色散力大）。当前第25页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

三、仪器装置：用以涂布薄层用的载板有玻璃板、铝箔及塑料板当前第26页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

四、实验技术

实验技术包括：①吸附剂的选择和制备；②薄板的制备；③薄板的活化；④点样技术；⑤展开技术；⑥显色技术。当前第27页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

1.吸附剂的选择和制备：⑴硅胶(Silicagel):

无定形多孔物质，适用于酸性和中性物质的分离。硅胶H──不含粘合剂硅胶G──含煅石膏(gypsum)做粘合剂。有时淀粉、CMC等也可用做粘合剂。硅胶HF254──含无机萤光(fluoresent)物质，在254nm下观察萤光。硅胶GF254──含煅石膏和无机萤光物质。当前第28页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

1.吸附剂的选择和制备：⑵氧化铝:

无定形多孔物质，也有氧化铝H、氧化铝G、氧化铝HF、氧化铝GF等型号，还有酸性、中性、碱性氧化铝之分。氧化铝一般在100-150目。

酸性氧化铝──10%HCl浸泡过夜，水洗至pH值=4，适用于酸性物质的分离。酸性氧化铝适用于pH4~4.5的酸性有机酸类的分离。10min

(pH=4指1gAl2O3+10ml水───→测滤液之pH值)△当前第29页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

中性氧化铝──10％HCl浸泡过夜，水洗至pH值=7，适用于分离中性物质。中性氧化铝适用于醛、酮、醌、酯等pH约为7.5的中性物质的分离。碱性氧化铝──水中浸泡过夜，pH≈10,适用于分离碱性物质。碱性氧化铝，适用于碳氢化合物、生物碱及碱性化合物的分离，一般适用于pH为9-10的环境。当前第30页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

1.吸附剂的选择和制备：⑶聚酰胺：

由酰胺聚合而成的高分子，其分子内存在着许多酰胺基，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键而产生吸附作用，根据样品中组分的结构不同（如能形成氢键基团的数目、位置以及双键和苯环数目的多少等）与聚酰胺产生吸附作用的强弱不同，从而使样品达到分离。O│

聚酰胺：─C-NH-(CH2)5─当前第31页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

1.吸附剂的选择和制备：⑶聚酰胺：聚酰胺可由锦纶丝制备，也可直接购买商品薄层色谱用聚酰胺薄膜。由锦纶丝制备聚酰胺固定相有两种方法：当前第32页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

1.吸附剂的选择和制备：⑶聚酰胺：a.冰醋酸法：当前第33页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

1.吸附剂的选择和制备：⑶聚酰胺：b.浓盐酸法:当前第34页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

1.吸附剂的选择和制备：⑷葡聚糖凝胶：

凝胶可将分子大小和形状不同的物质分离，好象用过筛的方法把大分子与小分子分开一样。因此凝胶又称为凝胶分子筛。葡聚糖凝胶是一种广泛应用的凝胶，它是由一定分子量的葡聚糖悬浮于有机相中，再加入交联剂表氯醇使葡聚糖交联聚合而成（可直接购买商品使用）。它适用于蛋白质、多糖等大分子物质的分离和提纯。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。当前第35页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

2.展开技术:⑴展开剂的选择（技术关键，对分离效果影响最大）：根据样品的极性，溶解度以及吸附的活性等因素来选择展开剂。原则１：展开剂对被分离物质有一定的解吸能力（否则，不能将Ａ解吸下来，Ａ会待在原点不动），但又不能太大（否则，Ａ不被吸附，而是跟着Ｓ一起跑，达不到分离的目的）；展开剂的极性应略小于被分离物质。原则２：展开剂对被分离物质有一定的溶解度（否则，被顶出的Ａ不溶于Ｓ，就不会随着Ｓ向前移动）。当前第36页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

2.展开技术:⑴展开剂的选择实际操作时，可参考下列溶剂的洗脱能力顺序：

硅胶板上：乙腈＞二氧六环＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞二氯甲烷＞氯仿＞苯＞四氯化碳＞戊烷氧化铝板上：乙酸＞甲醇＞异丙醇＞吡啶＞乙腈＞二甲亚砜＞乙酸乙酯＞二氧六环，丙酮＞二氯乙烷＞四氢呋喃＞二氯甲烷＞氯仿＞乙醚＞苯＞甲苯＞四氯化碳＞环己烷＞石油醚＞戊烷当前第37页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

2.展开技术:⑴展开剂的选择说明:①实际工作中，某些溶剂的顺序会有颠倒出入，所以以上顺序只作参考。②实际工作中,更常用到二元、三元混合溶剂作展开剂，这时可参考有关资料。（例如，分离氨基酸时，可找有关氨基酸分离的资料）利用资料上报导的展开剂试验时，往往还要经过实验来确定合适的展开剂。当前第38页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

2.展开技术:⑵展开方式:

a.上升法:适用于硬板。b.倾斜上升法:适用于软板。c.下降法:此法受重力影响，展开速度较快，但有时前沿不整齐。d.双向展开:使用方形玻板，样品点在角上，先用一种展开剂展开，将玻板转动90°后,再用另一种展开剂展开。此法适用于较复杂的样品。当前第39页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

3.显色技术:⑴蒸汽显色:碘、溴、浓氨水等，放在干燥器中;

薄板挥去展开剂，放在上述干燥器中，显色时间与灵敏度随化合物而异。碘遇有机物显黄－黄棕色斑点，拿出后迅速用铅笔画下斑点的形状及位置。当前第40页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

3.显色技术:多数有机化合物吸附碘蒸气后显示不同程度的黄褐色斑点，这种反应有可逆及不可逆两种情况。前者在离开碘蒸气后，黄褐色斑点逐渐消退，并且不会改变化合物的性质，且灵敏度也很高，故是定位时常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸气氧化、脱氢增强了共轭体系，因此在紫外光下可以发出强烈而稳定的荧光，对定性及定量都非常有利。当前第41页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

3.显色技术:⑵喷雾显色:

将显色剂(与被分离物质有颜色反应的物质)配成溶液，装入喷雾器中，喷洒在薄板上，必要时可用热吹风加热。(见教材P267表10-1及陈耀祖书P47附录.显色剂)当前第42页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

五、应用1.定性：

以Rf值为指标。在一定条件下，各种有机物的Ｒf值是特定的常数，但“一定的条件”不易保证（如吸附剂的活性、取样量的大小、展开槽的饱和程度、边缘效应、薄板的厚度、展开方式等），所以最好用标准样品做对照。当前第43页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

五、应用1.定性：应用实例：例１用薄层色谱分离测定表面活性剂：硅胶G，碘蒸气显色硅胶G，碘蒸气显色C18反相硅胶板，碘蒸气显色展开剂：CH2Cl2/CH3OH(8∶1)展开剂：CH2Cl2/CH3OH/HAc(8∶1∶0.75)展开剂：C2H5/2%Na2B4O7.10H2O(8∶2)阴离子表面活性剂Rf阳离子表面活性剂Rf非离子表面活性剂Rf十二烷基硫酸钠0.15十六烷基三甲基氯化铵0.21十二烷基酚聚氧乙烯醚0.54十二烷基苯磺酸钠0.09十六烷基氯化吡啶0.27月桂酸钠0.70十二烷基胺0.42乙烯加合物(n=10)0.70二辛基硫代琥珀酸钠0.28十八烷基胺0.55壬基酚聚氧乙烯醚(n=5)0.45当前第44页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

五、应用1.定性：例２氨基酸的分离：试样：天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸的混合物。吸附剂：硅胶Ｇ(厚0.25mm).展开剂：①水：乙醇：乙酸(1:5:0.1);②苯酚:水(4:1)

展开距离：10厘米(约45min)

显色：茚三酮正丁醇溶液，110℃加热，天冬氨酸显紫色，其余均显桃红色。

根据此法可设计猪皮、羊皮、牛皮中各种氨基酸含量的分析方法。当前第45页\共有54页\编于星期四\4点第二章薄层色谱

五、应用1.定性：ＴＬＣ在定性方面的应用，除了鉴定示知物以外，还有下列用途①检验药物的纯度及其中的杂质。将药样溶液点在薄板上，经展开后，应只出现一个与标准样品位置一致的斑点，若试样出现另外的斑点，即表明其中有杂质存在。若事先测也显色剂对杂质的取小检出量，则可用薄层色谱法做杂质的限量检查。例如，若最小检出量为0.5μg,在薄层上点样100μg后,不出现杂质的斑点，即说明试样的纯度不低于9