上海市临检中心 PCR人员上岗培训班 分子病理技术及质量控制 3.24何妙侠

分子病理检测技术及其质量控制Pathological

change第二军医大学长海医院病理科何妙侠主讲内容分子病理的发展常用分子病理技术PCR检测技术的质控主讲内容分子病理的发展常用分子病理技术PCR检测技术的质控DNA的发现分子病理学免疫病理学免疫学和标记技术超微病理学细胞病理学电镜1858-AD体液器官病理学460-377-BC分子病理时代是必然趋势组织学/细胞学IHC/ICC原位杂交技术基于PCR技术的检测大体检查现代病理学诊断形态学、免疫组织化学和分子诊断的综合性诊断靶向药物要求对肿瘤进行分子分型组织学驱动性突变NSCLC

的分群治疗Non-squamousSquamousSquamousSquamousAdenocarcinoma2010EGFR

MuEGFR

WTNCCN2012Squamous-cellcarcinomaOthernon-squamousWTEGFR

Mu

ALK+

KRAS

MuNCCNNo

mutation

detectedKRAS

(22%)EGFR(17%)EML4-ALK

(4-7%)Double

mutants

(3%)RETMEK1Large

cell

carcinomaMET

AMPHER2PIK3CANCCNGuidelines

Version

2.2013

of

Non-Small

Cell

LungCancerHorn

L,PaoW.

J

Clin

Oncol.2009;26:4232–4235.BRAF(2%)ROS1部分常规靶向治疗预测指标的检测项目靶向治疗靶点肿瘤类型antibodiesTrastuzumabRituximab乳腺癌（BC）B细胞淋巴瘤HER-2CD20结直肠癌（CRC）CetuximabBevacizumabPanitumumabsmall

moleculeinhibitorsImatinibEGFR/KRASVEGFBreastCa/CRC/非小细胞肺癌（NSCLC）EGFRCRCc-kit/

BCR-ABLEGFRGIST/CML肺癌GefitinibErlotinibEGFRNSCLC/胰腺癌LapatinibHer-2

&EGFRVEGFRs/

PDGFR/RAFVEGFRs/

PDGFR/RETBC肝细胞肝癌（HCC）/肾细胞癌（RCC）SorafenibSunitinibRCC

&GISTTensirulimus/EverolimusBortezomibmTORRCC多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤Proteasome皮肤T细胞淋巴瘤VorinostatBortezomibHDACQuek,Yan,Yong

and

Salto-Tellez.Personalized

Medicine（2009）

6(5),465-468分子病理学开启个体化治疗新时代的金钥匙Pathological

change分子病理时代主讲内容分子病理的发展常用分子病理技术PCR检测技术的质控常用分子病理检测技术

免疫组化

原位杂交

PCR扩增常用分子病理检测技术

免疫组化

原位杂交

PCR扩增常用分子病理检测技术

免疫组化

组织适当固定

切片的质量

抗原修复

去除非特异性背景

抗体的质量与稀释

孵育时间

充分洗涤

适当显色

设立阳性与阴性对照

正确判读结果ERcerbB2常用分子病理检测技术

免疫组化原位杂交PCR扩增石蜡包埋组织FISH检测

3-5μm切片

涂胶白片

取材位置

乳腺Ca:EBC优选原位癌/MBC优选转移灶活检样本

胃Ca：手术切除标本（6-8个高质量、有代表性的样本最为理想）FISH第一天操作流程1、从石蜡包埋的癌组织中获取多块4μm切片，分别置于涂胶白片上2、将玻片置于65℃烤箱内烘烤2小时以上3、将玻片浸入二甲苯中脱蜡各2次，每次10分钟4、将玻片浸入100%乙醇中5分钟5、将玻片依次浸入100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各3分钟复水6、将玻片浸入去离子水（pH=7.0-7.2）中5分钟7、将玻片浸入放有去离子水的考普林瓶中，95℃水浴25分钟8、取0.4ml蛋白酶K储存液（20mg/ml）溶于40ml

2×SSC(pH7.0-7.2)得到蛋白酶K工作液(200μg/ml)FISH第一天操作流程9、将玻片浸入蛋白酶K工作液中，37℃下消化10分钟10、玻片经蛋白酶K消化后，于2×SSC溶液中漂洗1次，10分钟11、将漂洗完的玻片浸入含2.5%甲醛的PBS缓冲液中10分钟12、将玻片依次浸入70%乙醇和100%乙醇中各3分钟脱水13、自然干燥玻片14、将8μl杂交缓冲液和2μl探针加入到EP管中15、将10μl的探针混合物滴于玻片杂交区域即加盖玻片，用封片胶封边16、避免盖玻片与玻片之间产生气泡，待封片胶干燥后，检查有无封严17、将玻片置于82℃的热台上，变性8分钟18、变性完之后，将玻片移至湿盒中，42℃保温过夜，待第二天洗片FISH第二天操作流程1、去掉封片胶，移去盖玻片，立即将玻片浸入46℃水浴锅中的2×SSC溶液中，晃动玻片3秒钟，5分钟后取出玻片2、将玻片浸入46℃水浴锅中盛有2×SSC/50%甲酰胺溶液的瓶中，晃动玻片3秒钟，4分钟后取出玻片3、再将玻片浸入另一瓶46℃水浴锅中的2×SSC溶液中漂洗1次,3分钟后取出玻片4、将玻片浸入在70%乙醇和100%乙醇中各3分钟后取出玻片5、暗处自然干燥玻片6、将10μlDAPI复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片7、置暗处10-20分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤波片观察FISH实验主要存在问题

脱蜡不完全彻底

抗原修复不彻底

消化控制不良

背景缓冲试剂配置没到中性

杂交变性温度及过夜湿度不恰当

洗片不到位

结果判断不标准43/F

乳腺癌IHCC-erbB-2

+++FISH

阳性HER-2

成簇扩增

重叠的细胞，尽量回避，不去计数。

若癌区很少，不得不计数时，重叠区域内的信号只计数一次。

两信号点中还能加入一个相同大小的信号点，判读为2个信号点

两信号点中无法加入一个相同大小的信号点，判读为分裂型的1个信号点

信号点呈条带状，只要中间不断开，判读为1个信号点。常用分子病理检测技术

免疫组化

原位杂交PCR扩增常用分子病理检测技术

PCR扩增

DNA提取

PCR扩增

PCR产物鉴定石蜡组织DNA的提取•

切

片1

10μm石蜡切片6-10张置于1.5ml

EP管中或贴于干净载玻片上2

切片时尽量根据相应蜡块的形态学选取肿瘤组织去掉周围非肿瘤组织

，适当烤片•

脱蜡至水1

1200μl二甲苯，混匀，37℃，5min

，9000rpm离心，10min，小心吸弃二甲苯，重复1-2次2

1200μl无水乙醇，混匀，9000rpm离心，10min，小心吸弃乙醇，重复1-2次3

置于37℃EP管开盖，干燥2-3小时，如用载玻片就常规脱蜡至水用干净切片刀刮下组织放入EP管中，同法干燥石蜡组织DNA的提取•

备

注若临床提供标本为外周血或骨髓，均应加抗凝剂，低速离心小于1000转/min

离心5min；然后加入淋巴细胞分离液，常规分离淋巴细胞，低速离心15min，吸取淋巴细胞，再加直接加裂解液和蛋白酶K提取Tiangen基因组DNA抽提试剂盒•

消

化1

加入GA溶液，和蛋白酶

K(20

mg/ml)

20μl2

55℃过夜，至组织完全透明清澈，其间可根据组织大小分步适量再加5-10μl蛋白酶K，并间歇震荡3

加入200ulGB溶液，

70℃震荡混匀10min，使溶液变清亮，加入200ul无水乙醇，震荡混匀•

DNA抽提1

倒入收集管的吸附柱中，12000

rpm,

离心

30s，弃废液2

吸附柱中加入500ul

GD溶液，12000rpm,

离心

30s，弃废液3

吸附柱中加入500ul

PW溶液，12000rpm,

离心

30s，弃废液4

吸附柱中加入500ul

PW溶液，12000rpm,

离心

2min，弃废液5

12000

rpm,

离心

2min，弃废液，直至吸附柱管壁上无水珠Tiangen基因组DNA抽提试剂盒•

DNA洗脱1将吸附膜悬空，滴加50ul

TE洗脱液，室温静置5min2

12000rpm,离心

2min，收集洗脱液3将洗脱液反复加入吸附柱中，静置5min，12000rpm,离心

2min，收集洗脱液，-20℃冰箱保存•

DNA测定1

取5μl样本DNA，以TE缓冲液稀释100倍，用紫外分光光度计测定DNA浓度及OD值(260

nm/280nm)2

OD值(260nm/280nm)在1.8~2.0之间为妥3取1μl样本DNA，用1.5-2%琼脂糖凝胶电泳4-20℃冰箱保存PCR扩增•

PCR反应体系模板DNA

2.0

ul(1ug)2×Taq

PCRMasterMix

12.5

ulPrimer

1（10

uM）

1.0ulPrimer

2（10

uM）

1.0ulddH2O5.5ul总体积25.0

ul•

PCR反应循环预变性

94℃变性

94℃复性

55℃延伸

72℃充分延伸72℃5min1min45s1min10min35cyclePCR扩增•

PCR反应完成后处理95℃

5min4℃

1h然后4℃保存•

目

的去除异源双链聚合物去除引物二聚体PCR产物鉴定•

配制TAE电泳缓冲液，一般为0.5%•

配制琼脂糖凝胶，一般为1.5-2%•

电泳板上铺胶，注意点样孔•

点样，

注意操作琼脂糖凝•

电泳，

约30分钟胶

•

注意观察不能跑出胶外，

达胶的2/3处即可电

•

紫外灯扫描系统扫描观察结果泳

•

成像法•

注意非特异性条带的干扰•

阳性对照与空白对照PCR扩增注意事项

PCR扩增

组织适当固定

彻底脱蜡

完全消化

DNA浓度与质量控制

反应体系浓度

扩增条件

去除非特异性结合

正确的凝胶电泳

设立阳性与阴性对照

正确判读结果PCR扩增技术延伸

PCR扩增

PCR扩增--毛细管电泳

PCR扩增--片段分析与测序

PCR扩增--直接测序

qPCR-HRM法PCR扩增-毛细管电泳检测PCR扩增-片段分析与测序

PCR扩增•

片段分析将整个DNA作为一个整体进行分析•

测序分析分析DNA序列的碱基顺序，是否发生改变应用毛细管电泳片段分析PCR扩增直接测序的应用

适用：点突变小片段缺失插入突变

临床应用：胃肠道间质瘤

KIT

PDGFRA突变结直肠癌

KRAS

BRAF突变乳腺癌

EGFR

KRAS突变胃肠道间质瘤相关检测Real-Time

PCR

扩增技术

Real-Time

PCR扩增PCR反应体系中加入荧光探针实时监测整个PCR过程定量和定性分析包括

TaqMan法ARMS法

Real-Time

PCR荧光探针非特异性探针SYBR

Green特异性探针TaqMan

探针蝎形探针环形探针ARMS法结果判读主讲内容分子病理的发展常用分子病理技术PCR扩增检测的质控分子病理诊断的质量控制

专门的PCR认证实验室

经过培训的技术人员上岗

有资质的病理医师签发报告

标本质量过关

操作环节严格质控

结果判读标准化PCR扩增检测的质量控制标本质量过关

操作环节严格质控

结果判读标准化PCR扩增检测的质量控制标本质量过关

穿刺组织

新鲜组织

福尔马林固定石蜡包埋组织

血液

体液

骨髓液适用于突变检测的标本建议采用灵敏度RMS检测病理评估合格的标本适用基因突变病理学评估确认肿瘤细胞数大于100组织学观察标本接收、固定组织处理、石蜡包埋切片及H&E染色

标本通常较大，能提供足够的肿瘤组织用于检测

标本可以是冰冻或福尔马林固定组织支气管镜和细针穿刺活检标本

标本较小

通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理

建议采用灵敏度高的ARMS检测方法细胞学标本涂片、染色液基细胞学病理诊断病理诊断病理诊断胸水或支气管刷片或痰液细胞蜡块，切片染色

细胞学标本中通常肿瘤细胞数目较少，需要采用灵敏度高的ARMS检测方法

建议有条件的病理科制备细胞蜡块：

处理流程：细胞学标本经离心处理后，常规福尔马林固定、处理及石蜡包埋即可

制备细胞蜡块的好处：(1)便于长期保存(2)便于基因突变的检测及其他分子生物学标记物的检测标本的病理评估内容

诊断：确保肿瘤组织是非小细胞性肺癌（以肺癌为例）

肿瘤组织量：确保有足够的肿瘤组织用于突变检测

尽量保证200-400个肿瘤细胞对于技术成熟的实验室，可尝试进行＜200个肿瘤细胞标本检测

5-10uM

10张切片能满足突变检测需求当细胞数较少时,可以适当增加切片数,以满足检测需求

肿瘤比例：标识肿瘤丰富的区域，提高肿瘤细胞比例用于检测

尽量去除非肿瘤组织及细胞，提高检测的敏感性

不同敏感性的检测方法对肿瘤比例要求不一样测序法：＞10%ARMS法：＞1%肺癌的分类与基因突变的关系

贴壁为主型、乳头为主型、和腺泡为主型腺癌预后较好，EGFR基因突变率高

K-ras基因突变最常见于浸润性粘液腺癌和实体为主性腺癌

ALK融合基因最常见于含有印戒细胞的腺癌，以及腺泡型、乳头型、筛状和产生黏液的腺癌PCR扩增检测的质量控制

标本质量过关操作环节严格质控

结果判读标准化操作环节严格质控第一步

DNA提取第二步

加样上机第三步

结果判定阳性对照阳性对照突变信号不含突变的曲线图含突变的曲线图DNA的质量控制标本质量过关

切片量适宜

切片时每个标本间更换刀片

切片时戴手套

脱蜡彻底干净

严格控制样品间交叉污染DNA的质量控制常用DNA质控方法对比DNA评估参数方法适用DNA来源全部DNA可扩增

DNADNA

纯度Spectrophotometry分光光度计冰冻新鲜组织、全血、细胞系√X√Fluorimetry(eg.Picogreen)荧光染料冰冻新鲜组织、全血、细胞系√XXFFPE组织、血浆、血清以及其他来源高度降解DNAX√qPCRqPCR法定量的优点：排除DNA质量不符合要求样品，节省成本、时间

分光光度计（260nm处光密度值）和荧光染料法检测总DNA量

优点：简便缺点：无法评估可扩增的DNA片段和PCR抑制剂紫外分光光度计法

荧光定量PCR只检测可扩增的DNA片段的量，并评估是否有PCR抑制剂优点：FFPE来源DNA的最可靠，排除DNA质量不符合要求的样本（节省成本，时间）缺点：增加了检测所用时间，增加成本PCR

产物长度可扩增DNADNA

10倍稀释后加样操作注意事项正确操作错误操作枪尖不可伸入到封盖剂之下枪尖靠在管口伸入5mm处加入样品设定阈值阈值线使用软件自动设定的阈值，根据实际情况调节阈值设定在背景荧光信号之上，扩增曲线的指数期之内（LOG曲线下，背景荧光与平台期两者中间）设立阴性对照和阳性对照

阴性对照应无FAM荧光信号产生

阳性对照FAM和VIC信号均应升起，阳性质控品的Ct值一般小于20，但可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动设立样本外控

待测样本的外控应有FAM信号石蜡包埋组织切片样品，则15

≤

Ct值≤

21非石蜡切片样品，则13

≤

Ct值≤

19外控Ct值可能原因解决方法石蜡包埋组织样品，Ct＜15；非石蜡切片样品，Ct＜13。加入DNA过量稀释DNADNA含有抑制剂DNA量加入不够稀释或重新抽提DNA增加DNA用量石蜡包埋组织样品，Ct＞21；非石蜡切片样品，Ct＞19。设立样本内控

待测样本的内控(1-7号管的HEX信号曲线)应有扩增曲线1.

HEX有信号，FAM无信号

——质控通过2.

HEX无信号，FAM有信号

——质控通过3.

任何一管HEX，FAM均无信号—质控不通过（该样品数据无效）可能原因解决方法样品DNA中存在PCR抑制剂稀释或重新抽提DNADNA量加入不够加样时漏加DNA增加DNA用量重新检测PCR扩增检测的质量控制

标本质量过关

操作环节严格质控结果判读标准化结果判读标准化

同时选择同一号管的阳性对照、阴性对照和样品的扩增曲线

选定阈值线，判读Ct值阳性样品阳性对照阳性样品阴性样品基因检测报告标准模板

患者基本信息

基因检测结果和结论

检测方法和试剂

被检标本来源与部位

基本病理学状态；

标本种类与名称

肿瘤细胞数量；肿瘤细胞数所占比例等

DNA的质控结果

由病理医生签发备注：该检测结果仅对本次送检标本负责ARMS法ARMS

突变检测稀释DNA样品浓度到2-3ng/ul配制样品DN