第17章药物的遗传毒性及评价

药物毒理学第十七章药物遗传毒性及评价中国医科大学药学院药物毒理学教研室生物体亲代与子代之间进行遗传信息传递的物质成为遗传物质，它具有相对稳定、能自我复制、保持同一物种连续性、能产生可遗传的变异等特性。虽然遗传物质具有高度保真及稳定性，但在化学物质、电离辐射作用下，也会产生突变或变异，是遗传性状发生改变。一、基因突变（一）自发突变与诱发突变自发突变是在自然状态下基因结构发生的改变。发生率很低1/10000~1/10000000/生殖细胞/代。诱发突变是在外界因素影响下发生的基因结构的改变。第一节药物的遗传损伤类型（二）碱基置换与移码突变

碱基置换是某一对碱基配对性能改变或脱落而引起的基因结构改变。

转换-嘌呤被另一种嘌呤置换或嘧啶被另一种嘧啶置换颠换-嘌呤被嘧啶置换或嘧啶被嘌呤置换无论转换还是颠换都只涉及一对碱基，是名符其实的点突变

移码突变是DNA中增减或减少一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。移码突变较易产生致死性突变（三）同义突变、错义突变和无义突变同义突变：翻译得到的氨基酸没有改变错义突变：翻译得到的氨基酸发生改变无义突变：翻译终止二、染色体畸变（一）染色体结构异常1、染色体畸变⑴裂隙与断裂⑵无着丝粒断片和缺失⑶环状染色体⑷倒位⑸插入和重复⑹异位P1702、染色单体的畸变⑴染色单体裂隙、断裂和缺失⑵染色单体交换⑶姐妹染色单体交换（二）染色体数目异常

整体倍的畸变和非整体倍的畸变染色体畸变裂隙(gap)

断裂(break)断片(fragment)和缺失(deletion)

微小体(minutebody)

无着丝点环环状染色体

双着丝点染色体

倒位(inversion)

易位(translocation)

插入(insertion)和重复(duplication)辐射体

第二节药物致遗传损伤的机制一、直接以DNA为靶的损伤1、碱基类似物取代2、烷化剂的影响

烷基的活性取代嘌呤上的活性部分，使其脱落5-溴脱氧尿嘧啶取代胸腺嘧啶3、致突变物改变或破坏碱基的化学结构

亚硝酸根可以使嘌呤或嘧啶发生氧化性脱氨，从而破坏或改变碱基结构，有时还可以引起链的断裂。4、平面大分子嵌入DNA链

有些大分子能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻核苷酸之间造成移码突变。二、不以DNA为靶的间接诱变1、纺锤体抑制

作用于纺锤体、中心粒或其他核内细胞器，从而干扰有丝分裂的过程。可诱发突变。2、对酶促过程的作用

影响DNA合成和复制时的酶系统，间接影响遗传物质，从而诱发突变。第三节：药物致遗传损伤的影响因素及后果一、药物致遗传损伤的影响因素（一）机体对遗传损伤的修复作用1、光修复2、烷基修复3、切除修复⑴核苷酸切除修复⑵碱基切除修复4、误配修复5、复制后修复P172（二）影响药物致遗传损伤的因素1、遗传因素2、DNA修复能力的个体差异3、不同的生活方式（三）具有遗产毒性的药物1、改变碱基结构的药物2、致DNA断裂的药物3、影响有丝分裂的药物p173二、药物致遗传损伤的后果1、体细胞突变的后果2、生殖细胞突变的后果DNA损伤体细胞突变生殖细胞突变良性肿瘤恶性转化细胞衰老分化的胚胎细胞受损

未分化的胚胎细胞显性致死隐性致死存活突变动脉硬化未知疾病癌变老化出生缺陷(流产/死胎)癌变出生缺陷(功能或结构畸形)流产死产出生缺陷基因负荷先天性疾病遗传毒性的后果第四节药物致遗传损伤的检测方法一、致突变试验（基因突变实验、染色体分析、DNA损伤）（一）基因突变试验1、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验2、哺乳动物细胞基因突变试验3、果蝇伴性隐性致死性试验（二）染色体分析1、染色体畸变分析2、微核试验3、显性致死试验（三）DNA损伤实验1、姐妹染色单体交换（SCE）试验2、程序外DNA合成实验二、观察方法的更新与进展三、试验结果评定应注意的问题致突变试验中的一些问题(一)阴性和阳性对照的设立1．阴性对照它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础数据。例如，Ames试验的阴性对照可了解所用的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外无任何使回复突变率增加或减少的因素。

2．阳性对照是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，Ames试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。(二)体外试验的活化系统1．哺乳动物细胞介导使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9，但不如体内活化系统。2．S9S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000rmp离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，其缺点是S9随实验动物种属或器官不同而有差异；S9含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。3．纯化酶和基因工程应用纯化细胞色素P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因工程，将人的细胞色素P-450基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统。(三)致突变试验与致癌试验的关系①已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用等在哺乳动物实验中证实。②发现人类接触致癌物与DNA加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。③传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。(四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用阴性结果判定条件：①最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选LD50或LD80为最大剂量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验中可以5000μg／皿作为最高剂量。②各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。(五)试验结果在毒理学安全性评价中的作用阳性结果应具有剂量—反应关系，即随剂量增加，致突变作用增加；和在一组或多组的观察值与阴性对照比较有显著性差异。阳性结论，即表明受试物具有致突变性，而不同致突变试验的遗传学终点不同，其所表示的含义不一。如基因突变是具有导致遗传性疾病的突变，DNA修复的实际后果尚不明确。国际协调组织(ICH)(1997)对于药品的遗传毒性评价建议的检测试验组合为①细菌基因突变试验；②体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞比试验；③体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验(骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验)。在对经标准试验组合得到的致突变作用结果进行进一步研究时，其他试验如DNA加合物测定、DNA链断裂检测、DNA修复和重组试验等都可作为供选择的试验。对于在三项标准试验中为阴性的化学物，通常可认为其无遗传毒性作用。但对于构效关系显示有可能具致癌性或致突变性，但在三项标准试验中为阴性的化学物，还需要改进试验方法或再增加试验项目。对于在三项标准试验中为阴性，但致癌试验显示有致癌效应，又无明确的证据说明该化学物是通过非遗传毒性机制发挥作用时，为了了解其作用方式，可再进行改变代谢活化系统的体外试验或应用肿瘤发生的靶器官进行遗传损伤试验(如肝脏UDS试验、DNA加合物检测、转基因突变检测、肿瘤相关基因的遗传改变检测)。我国卫生部在《食品安全性毒理学评价程序》(1994)中对遗传毒理学试验的要求根据受试物的化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点的不同，并兼顾体外和体内试验以及体细胞和生殖细胞的原则，在Ames路试验、小鼠骨髓微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验、小鼠精子畸形试验和睾丸染色体畸变试验中选择四项，如其中一项试验为阳性，还应在其他备选试验(V79细胞HGPRT