菊苣根中黄酮的提取工艺大学本科毕业论文

长春工业大学PAGEPAGEII摘要菊苣为多年生草本植物，源于欧洲，现在广泛分布亚洲、美洲。菊苣根中含有蛋白质、糖类、脂肪、黄酮、纤维素等营养物质，其中黄酮含量较高，黄酮是一类以苯色酮环为基础的酚类化合物，具有保肝、降压、利尿等功效。本实验主要用单因素的实验方法，用超声波乙醇提取法和乙醇回流提取法提取黄酮，通过改变提取温度、乙醇浓度、提取时间、料液比，获得的提取液在紫外分光光度计下测其吸光度，通过其吸光度得到菊苣根中黄酮含量，通过两种方法的比较得到，乙醇回流提取法得到的黄酮含量较高，最优提取条件为：乙醇浓度70％，提取温度80℃，提取时间2.5h，料液比为1：20。再用正交实验优化乙醇回流提取法，得到对黄酮含量影响最大的是提取温度和乙醇浓度，其次是提取时间、料液比，在最佳提取条件下得最高总黄酮含量为7.74mg/g。关键词：菊苣根；黄酮；提取；正交AbstractChicoryistheperennialherb,mainlyfromEurope,nowwidelydistributedinAsia,theAmerica.Chicoryrootcontainsprotein,carbohydrates,fats,flavonoids,celluloseandothernutrients,highflavonoidcontent,flavonoidsareaclassofphenoliccompounds,benzenechromoneringhashepatoprotective,antihypertensive,diureticandothereffects.Withthemethodofsinglefactorexperiments,thisexperimentappliedultrasonicethanolextractionandhotwaterrefluxextractionmethodflavonoids,bychangingtheextractiontemperature,ethanolconcentration,extractiontimeandliquidtosolidrationinchicoryrootextractobtainedunderUVspectrophotometermeasuredabsorbancebytheabsorbance,theresultsshowsthathotwaterrefluxextractionmethodobtainedahigherflavonoidcontent,andfinaloptimizedconditionsforextractingflavonoidswasestablished,extracted2.5hourson80℃,ethanolconcentration70%andsolidtoliquidration1:20.Thentheorthogonalexperimenttooptimizethehotwaterrefluxextractionmethod,andgettoinfluencetheflavonoidcontentistheextractiontemperatureandethanolconcentration,followedbytheextractiontime,solidtoliquidratio,theflavonoidcontentis7.74mg/gunderthisoptimumconditions.Keywords:chicoryroot；flavone；extract；orthogonality长春工业大学PAGE27目录19404摘要 I10374Abstract II11900第一章前言 132604第二章文献综述 3324822.1菊苣的简介 368032.1.1菊苣叶简介 3262792.1.2菊苣根简介 469472.2总黄酮的简介 543412.2.1总黄酮的理化性质 575152.2.2总黄酮的功效成分 5305932.2.3总黄酮的营养价值 6205382.3菊苣根中总黄酮的提取方法 784522.3.1超声波乙醇提取法 7113852.3.2乙醇回流提取法 893582.3.3微波辅助提取法 8289632.3.4超临界提取法 882742.3.5加速溶剂提取法 9311502.4菊苣根中总黄酮的测定方法 920042.4.1亚硝酸钠－硝酸铝－氢氧化钠比色法 9250572.4.2紫外分光光度法 932462.4.3高效液相色谱法 10199972.5菊苣根总黄酮的研究目的与意义 10159332.5.1菊苣根总黄酮的研究目的 1088982.5.2菊苣根总黄酮的研究意义 108182第三章实验部分 1230033.1实验样品 12131163.2实验仪器与试剂 12321253.2.1实验仪器 1263663.2.2实验试剂 12253453.3实验方法 13204033.3.1菊苣根中总黄酮提取工艺 1321723.3.2菊苣根中总黄酮提取机理 132383.3.3芦丁标准曲线 1443243.3.4菊苣根中总黄酮提取方法 1541173.3.5总黄酮的测定—分光光度法 1629819第四章结果与讨论 1750664.1芦丁标准曲线的绘制 17145984.2菊苣根中总黄酮提取结果 18178644.2.1超声波乙醇提取结果 18226104.2.2乙醇回流提取结果 20111904.3菊苣根中总黄酮提取方法总结 2212334第五章结论与展望 2419975.1结论 24284315.2展望 2422361致谢 2519190参考文献 26第一章前言菊苣有欧洲菊苣之称，为菊科植物。源产于欧洲，在国外广泛用于生产饲料，也是制糖的原料。菊苣在20世纪80年代引入我国，并以一种良好的态势迅速成为受欢迎的高等保健型蔬菜和新型优良牧草。菊苣适宜在温暖湿润的气候下生长，但也耐寒、耐热，对土壤要求也不是很严格，在荒地、坡地、田地、草原均可生长，全国各地均适合种植。菊苣也可作为药材，它的提取物具有改善高血糖、高血脂、高尿酸等作用[1]。菊苣由地上地下两部分组成，地上部分叶片柔弱，嫩叶可以采摘食用，适口性好，营养价值高。地下部分为菊苣根，干燥菊苣根中菊粉含量非常高，菊粉中黄酮等含量很高，可作为低聚果糖、高果糖的生产原料。菊苣在许多国家广泛用作饲料、蔬菜和制糖原料,该植物根提取物还具有明显的保肝作用。菊苣根的水提取物还有降压、利尿等药理活性。菊苣根部经烘烤磨碎之后可以加入咖啡中作为增香添加剂或者咖啡的替代品，根煮熟后涂上奶油可食用，叶可以做沙拉，菊苣的嫩叶可以采摘食用，但是软化栽培的菊苣也可以生食，叶子可以蘸酱，或者做成凉拌菜，也可炒、煮食用，口感好。菊苣的根部重量是菊苣叶子的几十倍，但是往往被人们浪费，没有更加有效的利用其价值。菊苣根中含有黄酮，黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，如花青素、花色素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出，这种阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。黄酮可以抑制炎性生物酶的渗出，可以增进伤口愈合和止痛，栎皮素由于具有强抗组织胺性，可以用于各类敏感症。菊苣根中还含有蛋白质，氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，据报道菊苣根中含有都中含有多种人类所必需的蛋白质，氨基酸就有17种之多，而菊苣根中含有人类所需的8种必需氨基酸中的4种。所以我们可以把菊苣作为提取人类必需氨基酸的绿色原料。菊苣根中含有糖类，菊糖是自然界中天然存在的功能性食用多糖,具有抗消化特点,有水溶性膳食纤维和生物活性的生理功能,可增加人体内碳水化合物的供能时间而又不会显著提高人体内血糖水平。菊苣根中含有脂肪，菊苣根中的脂肪含量相对较低，只有2%左右，菊苣根中有人体所必需的亚麻酸和亚油酸及其他不饱和脂肪酸，但含量较少。菊苣根中还含有维生素，目前已有很多国家开发并食用菊苣根，将菊苣根作为膳食纤维食用[2]，因为菊苣根有特殊的苦味。因菊苣根中黄酮含量较高，所以用超声波乙醇提取法和热水回流提取法提取菊苣根的黄酮，采用单因素实验和正交的实验方法，得出菊苣根中黄酮提取的最优条件为：乙醇浓度70％，提取温度80℃，提取时间2.5h，液料比为1：20。菊苣自从引入我国以来，以其营养价值高、营养丰富、食用口感好和烹制方便而深受人们欢迎。目前，在我国华北与山东省均已有大面积的人工种植，其药用价值和营养价值正在被开发应用中，近些年来菊苣在我国的种植面积呈逐年上升的趋势发展。

第二章文献综述2.1菊苣的简介菊苣为菊科多年生\o"医学百科：草本"草本植物，根为肉质、短粗、肥大，茎直立，有棱，\o"医学百科：中空"中空，多分支，叶互生，为倒披针形，头状花序，花冠舌状，花色青蓝。高40-100cm。菊苣耐寒、耐旱，喜欢阳光，15℃～25℃下生长迅速，即使夏季温度高，但是仍具有较强的生长能力。菊苣的耐寒性也较强，在-8℃～-10℃时仍能生长完好，在-15℃～-20℃下亦能生长。菊苣根系较发达，抗旱性较好，而且较耐盐碱，pH为8.2的土地时生长良好。菊苣对图2-1菊苣土壤的要求不严格，旱地、水浇地均可种植。菊苣在夏季播种或者秋季播种时，当年基本不抽茎，而是第二年开始抽茎，并开花结实。生长为两年以上的植株，根颈上不断生长出新的萌芽，并逐渐取代老的植株。菊苣种子一般是在受粉后的20天左右即为发育成熟，11月底开始停止生长，春季播种生育期为150天左右。2.1.1菊苣叶简介菊苣地上部分叶片丛生于短缩茎上，基本呈倒披针形，先端渐尖，叶缘呈齿状，叶片呈叶绿色至深绿色，有些品种的叶脉带有紫红色晕斑，叶面有稀疏的绒毛。叶簇开展度很少成斜直立生长，或平展生长，都不形成叶球，利用其肉质直根进行栽培。叶片质地较薄，两面长稀疏的多细胞长节毛，但叶脉处及边缘的毛较多。菊苣叶片柔嫩多汁，营养丰富，叶丛期粗蛋白质含量22.87%，初花期粗蛋白质含量14.73%平均17%。粗蛋白质产量达250kg/亩。初花期含粗图2-2菊苣叶脂肪2.1%，粗纤维30.6%[3]。菊苣氨基酸含量丰富，叶丛期9种必须氨基酸含量高于苜蓿草粉，菊苣根中含有丰富的β—胡萝卜素、维生素C与维生素B，所以菊苣根可以用来做维生素的开发，如单体维生素、复合维生素或者添加于食品之中作为维生素的补充剂，相信菊苣根以其丰富的维生素储存含量，便宜的市场价格，安全之质量保证，将会得到更多的厂家所青睐，会成为炙手可热消费物品，适口性非常好。2.1.2菊苣根简介菊苣根及菊苣干燥的根，秋季采挖，除去杂质，晒干。菊苣根呈圆锥形，根肥大，有侧根及多数须根，长为10-20cm，直径为0.5-1.5cm。表面基本为棕黄色，有细腻而不规则的纵皱纹，质较硬，不易折断，断面外侧呈黄白色，中部为白色，有时有空心的情况，气微，微苦。菊苣根顶端有时有2-3个叉，嚼之有韧性。图2-3菊苣根有资料证明：人工栽培的菊苣根提取物具有保肝的作用，王良信动物实验结果显示：30只雄性大鼠分为4组，第1组为CCl4对照组,第2组为模型组,第3组为CCl4+黄酮类制剂组,第4组为菊苣根提取物+CCl4组。第3和4组在用CCl4诱导肝炎前7d给以相应药物,菊苣提取物以50mg/kg剂量灌胃,对照组给等量的水,黄酮类制剂剂量也是50mg/kg。试验15d后处死大鼠。根据邻甲苯胺反应计算大鼠血浆中葡萄糖水平、苯丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶活性。取大鼠肝脏中叶染色制作切片,进行组织学研究。结果显示,模型大鼠天冬氨酸转氨酶活性比正常动物提高69%,天冬氨酸转氨酶/苯丙氨酸转氨酶之比增至0.79(对照组为0.55),表明肝脏功能受到破坏。给以提取物后,大鼠血浆中肝炎毒性产生的影响降低了18%,使用提取物和黄酮类制剂后,天冬氨酸转氨酶活性分别比对照组降低了27%、47%。CCl4使大鼠血浆中葡萄糖水平降低了54%,表明器官对葡萄糖合成与储藏能力受到破坏；而给以提取物后,葡萄糖水平趋于正常[4]。人工栽培的菊苣根水提物还具有降压、利尿等作用。将菊苣干燥根粉碎,用水提取并制成注射液,分为0.79g/kg、1.74g/kg和3.84g/kg3个剂量组,取家兔放在固定架内,乌拉坦麻醉后(5mL/kg),注射肝素、葡萄糖盐水使血压平稳,插气管插管和尿液导管,连接血压换能器,家兔血压稳定后再注射栽培菊苣注射液,一次给药量为0.5～1mL/kg,给药前每次注射生理盐水1～2mL/kg,观察给药前后家兔的血压和尿液变化。结果:石油醚部分中分离得到三个化合物,分别为β-谷甾醇,豆甾醇及菜籽甾醇；乙酸乙酯部分分离得到2个化合物,均为有机酸类；CO2超临界萃取物中确定二个化合物,即棕榈酸和十五二烯醇；家兔的药理实验表明：菊苣的水提物具有降血压和利尿的作用,而且随着给药剂量的增加,降压作用及利尿作用明显增强[5]。2.2总黄酮的简介黄酮是一类以苯色酮环为基础的酚类化合物。在植物中是由苯丙氨酸产生的肉桂酰辅酶A，是经碳链延长环化生成的查耳酮，再进而衍生成的各种α苯基衍生物。黄酮类化合物是指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而形成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。黄酮类化合物结构中常常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合生成苷。黄酮类化合物是在廿世纪八十年代末作为保健产品引起国际医药界的关注，临床医学研究人员发现其黄酮类化合物具有抗哮喘、防止长期抽烟引起的脑动脉硬化与脑血栓的形成以及降血压、血脂作用等。进而表明黄酮具有多样化的药理作用。2.2.1总黄酮的理化性质天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、联接位置以及联接方式的不同，可以组成各种各样的黄酮苷类。组成黄酮苷类的糖类包括单糖、双糖、三糖和酰化糖。黄酮苷固体为无定形的粉末，其余黄酮类化合物多为结晶性固体。黄酮类化合物不同的颜色为天然色素家族添加了更多色彩。这是由于其母核内形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭链延长，因而显现出颜色。黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂中；但难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。糖链越长则水溶度越大。黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性。酸性强弱因酚羟基数目、位置而异。黄酮具有显色反映：盐酸-镁粉（或锌粉）反应为鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应，反应机理现在认为是因为生成了阳碳离子缘故；四氢硼钠（NaBH4）是对二氢黄酮类化合物专属性较高的一种还原剂，产生红～紫色。而与其它黄酮类化合物均不显色。黄酮类化合分子中常含有下列结构单元，故常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐、锶盐、铁盐等试剂反应，生成有色络合物；与1%三氯化铝或硝酸铝溶液反应，生成的络合物多为黄色（λmax=415nm），并有荧光，可用于定性及定量分析。2.2.2总黄酮的功效成分黄酮广泛存在自然界的某些植物和浆果中，总数大约有4千多种，其分子结构不尽相同，如芸香苷、橘皮苷、栎素、绿茶多酚、花色糖苷、花色苷酸等都属黄酮。不同分子结构的黄酮可作用于身体不同的器官，如银杏山楂--心血管系统，蓝梅--眼睛，酸果--尿路系统，葡萄--淋巴、肝脏，接骨木果--免疫系统，平时我们可以通过多食葡萄、洋葱、花椰莱、喝红酒、多饮绿茶等方式来获得黄酮，作为身体的一种补充。二十年前，科学家发现具有活化石之称的银杏树中含有相对较多的黄酮，现在主要从银杏叶中提取黄酮。菊苣根中含有微量的黄酮，据相关报道主要有黄酮类（Flavones）、黄酮醇类（Flavonols）和花色素类（Anthocyans）等。黄酮类主要有5,7,4’—三轻黄酮（Apigenin）3，5，7，3’,4’,5’—六经黄酮（Myrieetin）以及黄酮糖苷等。黄酮醇类有山奈酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）及它们与葡萄糖组成的单糖（QMG）和二糖苷（QDG）句至多糖苷（QPG）。花色素类主要是由花青（Cyaniding），花葵素（Pelargonidin）与葡萄糖组成的葡糖苷[6]。黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，为研究菊苣根中总黄酮的抗氧化性质，分别测定了菊苣根中总黄酮对·OH的清除作用、对·O2-的清除作用和对脂质过氧化的抑制作用。结果表明：菊苣根中总黄酮对·OH的清除能力、对·O2-的清除能力和脂质过氧化的抑制能力EC50分别为24.65μg／mL、57.01μg／mL和42.87μg／mL，菊苣根中总黄酮具有较强的抗氧化的作用[7]。可有效清除体内的氧自由基，如花青素、花色素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出，这种阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。2.2.3总黄酮的营养价值黄酮可以改善血液循环，方法：测定的总黄酮灌胃给药对家兔血黏度和血小板聚集的影响。结果：总黄酮灌胃30～120mg/kg可显著降低家兔全血黏度、红细胞压积和红细胞聚集指数；抑制腺苷二磷酸诱导的家免血小板聚集。结论：总黄酮具有改善家兔血液流变性、血小板聚集作用[8]。可以降低胆固醇，向天果中的黄酮还含有一种PAF抗凝因子，这些作用大大降低了心脑血管疾病的发病率，也可改善心脑血管疾病的症状。被称为花色苷酸的黄酮化合物在动物实验中被证明可以降低26%的血糖和39%的三元脂肪酸丙酯，这种降低血糖的功效是很神奇的，但更重要的是它对稳定胶原质的作用，因此它对糖尿病引起的视网膜病及毛细血管脆化有很好的作用。黄酮可以抑制炎性生物酶的渗出，可以增进伤口愈合和止痛，栎素由于具有强抗组织胺性，可以用于各类敏感症。它的抑制细胞免疫和体液免疫以及调节细胞凋亡等作用也日益受到重视[9]。一项由荷兰专家主持的研究发现：由4807位参与者的实验表明，每天饮375毫升绿茶的人，其心脏病的发病概率是那些不喝茶的人的一半；致命性心脏病发病率只有三分之一。其中重要的原因就是绿茶中所含的黄酮。来自南太平洋岛国的向天果，富含33种类黄酮，可以帮助人体改善血液循环，提高免疫力，是糖尿病、高血脂、高血压患者的福音。蜂胶是蜂蜜从植物新生枝芽或树皮上采集的树胶，混以自身分泌加工而成的芳香胶状体。4～5万只蜜蜂，一年仅能采到40g～60g左右的蜂胶，被誉为“紫色黄金”。蜂胶皇是蜂胶中的极品，其总黄酮含量高达9300mg以上，且其余成份黄金配比，协同作用。科学家们给予蜂胶皇许多美称：血管清道夫、血糖守护神、抗癌勇士、天然免疫增强剂。高纯度大豆异黄酮对小鼠肝癌、乳腺癌有明显的抑瘤作用[10]。黄酮对许多疾病具有防治作用,揭示黄酮类化合物的吸收和代谢有利于了解其功效机制。黄酮的吸收和代谢水平依不同细胞而异,但主要受到胞内代谢的水平和它们从细胞中向外转运速度的影响[11]。黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，如槐米中的芦丁和陈皮中的陈皮苷，能降低血管的脆性，及改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，用于防治老年高血压和脑溢血。由银杏叶制成的舒血宁片含有黄酮和双黄酮类，用于冠心病、心绞痛的治疗[12]。黄酮具有降低血糖和血脂的作用[13]。全合成的乙氧黄酮又名心脉舒通或立可定有扩张冠血管、2-苯基色原酮分子结构增加冠脉流量的作用。许多黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、抗病毒的活性[14]。护肝，解肝毒、抗真菌、治疗急、慢性肝炎，肝硬化。2.3菊苣根中总黄酮的提取方法2.3.1超声波乙醇提取法超声提取法是利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解，显著提高提取效率的提取方法。用超声波提取酸枣仁总黄酮的最佳工艺条件。采用超声提取50min对酸枣仁总黄酮的提取效果进行分析,确定最佳提取方法。以乙醇浓度、料液比和提取时间为因子进行单因素试验和正交试验,确定超声波提取酸枣仁总黄酮的最佳工艺。用超声波提取确定为理想的提取方法。影响总黄酮得率的主次因素为料液比>乙醇浓度>超声提取时间。超声波提取酸枣仁总黄酮的最佳工艺条件为:70%乙醇,料液比1∶30,超声提取50min提取2次,提取率达到98.73%。采用超声波提取法的研究为酸枣仁总黄酮的工业化生产提供了参考依据[15]。2.3.2乙醇回流提取法应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。优选瓜馥木总黄酮提取工艺。采用传统乙醇溶剂热回流提取黄酮,利用紫外分光光度法测定黄酮含量。通过单因素实验考察温度、乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数对黄酮提取率的影响规律,并通过正交实验确定各因素对黄酮提取率的影响。黄酮最佳提取工艺条件为温度75℃,乙醇浓度60%,料液比1:25,提取时间4.0h,提取次数5次,平均黄酮提取率为6.805%[16]。2.3.3微波辅助提取法微波辅助(MAE)提取法是利用微波加热与固态样品接触的溶剂,使所需的化合物从样品中分配到溶剂里的一系列提取过程。提取在密闭或敞开的微波-透明容器中,提取溶剂和样品混合在里面,同样接受到微波能。溶液中的微波(电介质)可以加热。首先进行了单因素试验,在此基础上设计了L9(34)四因素三水平正交试验。确定了微波辅助法提取黄酮的最佳工艺条件为:以95%乙醇为提取剂,微波功率500W,微波温度65℃,提取时间8min,提取液料比10:1(ml·g-1),最佳条件下的提取率为0.738mg·g-1。结果表明,微波辅助萃取法有省时、节省溶剂、提取率高等优点,有较大的推广价值[17]。2.3.4超临界提取法超临界流体用作植物物质,环境样品,聚合物和食品提取的溶剂(6-8).大多数超临界提取(SFE)采用超临界二氧化碳,添加或不添加有机溶剂修饰剂。SFE具有分析选择性,提取功率可通过调节超临界流体密度和温度及压力进行微调。超临界流体的溶和功率可通过添加极性溶剂如丙酮或氯化亚甲烷来调节。本技术对基质和分析物的依靠性很强,必须针对每一种物质和分析物进行优化，本技术相对较快,提取时间少于1h。很多SFE生产厂家提供了各种自动和手动的提取仪器.样品装进高温高压管中,超临界流体穿过样品,并在含分析物的溶剂中减压或聚集在吸收区以便于回收。通过单因素试验研究了溶剂比例、温度、时间、压力对超临界CO2萃取毛白杨雄花序黄酮类化合物的影响，利用正交试验的方法得到最佳工艺条件：温度60℃,液料比15∶1、压力35MPa条件下,萃取90min,得率可达0.59%[18]。2.3.5加速溶剂提取法加速溶剂提取是在较高温度(一般为50-200℃)和压力1500-2000psi下进行液-固提取的方法.任何溶剂或溶剂混合物均可使用,少于15mL体积的溶剂需要10g样品.样品装进管中,高温加压液体穿过样品,然后冷却,收集。目前,只有一种加速溶剂提取系统达到产业生产规模,这是一种自动设备。相关技术应用于聚合物,动植物组织,食品和环境样品.美国环境保护协会(EPA)固态废弃物办公室已批准采用本技术提取部分挥发有机化合物,作为SW-846的第三代技术.2.4菊苣根中总黄酮的测定方法2.4.1亚硝酸钠－硝酸铝－氢氧化钠比色法原理是在待测物的水溶液中，加入亚硝酸钠－硝酸铝－氢氧化钠试液，铝离子与黄酮类化合物3，4，二羟基发生络合反应显色来进行测定。例如芦丁化合物B环上有邻二酚羟基，与铝离子络合，在500nm处有最大吸收，如果供试品显色后在同一地方有最大吸收，即可以芦丁做对照品，用比色法进行测定。采用氯化铝法、硝酸铝-亚硝酸钠法分别测定大叶冬青叶中的总黄酮含量。实验结果表明两种方法的测定结果相差很大,通过显色机理的分析,确立了氯化铝法为总黄酮含量测定的适宜方法,方法的回收率90.7%～99.5%,平均回收率为97.8%,相对标准偏差2.2%。通过正交试验研究了总黄酮提取工艺,结果表明其适宜工艺条件为液料比12:1(V/m)、乙醇浓度60%、提取时间2h、提取次数2次,此条件下总黄酮得率为0.68%[19]。2.4.2紫外分光光度法黄酮类化合物由于均具有α－苯基色原酮的基本结构，羰基与二个芳香环形成两个较强的共轭系统，对紫外光区相应有两个区域的特征吸收。吸收带I在较长波长（330～380nm）；吸收带II在较短波长（240～280nm）。经分离纯化的待测样品中主要含有黄酮类成分，其紫外光谱中有两个特征吸收带，因此可以选用其中主要的黄酮成分作为对照品测定总黄酮含量。为建立一种检测保健食品中总黄酮含量的快速分析方法,以活性成分芦丁为标准品,在其紫外最大吸收峰415nm处测定其总黄酮的含量。方法的最低检测浓度为0.1μg/mL,芦丁标准品在10～250μg/mL范围内具有良好线性关系。平均加样回收率0.9762%,相对标准偏差为1.85%，该方法简便,重现性好,可作为检测保健食品中总黄酮含量方法之一[20]。2.4.3高效液相色谱法如果待测物中，总黄酮的大多数成分明确、含量高、易得到可供含量测定用的对照品，则可用高效液相色谱法直接测定总黄酮的含量或者样品经过处理，测定指标成分含量，再换算成总黄酮含量。对HPLC法测定大豆异黄酮的方法进行了研究。结果表明,采用C18色谱柱,柱温40℃,以甲醇-冰醋酸水溶液为流动相,流速1.0mL/min,254nm紫外检测器进行检测,其重复测定结果的相对标准偏差均小于5%,人员之间重复测定结果的平均值接近,相对标准偏差在0.28%～3.78%之间,回收率在95.15%～104.92%范围内,相对标准偏差均小于2%。所建立的HPLC法适用于大豆异黄酮的测定[21]。2.5菊苣根总黄酮的研究目的与意义2.5.1菊苣根总黄酮的研究目的为了更清楚的了解菊苣根中黄酮的提取，我们做了大量实验研究和查阅很多资料参考，首先从菊苣的植物学特征，了解菊苣的外表特征，了解菊苣叶、菊苣根的特征及其营养药理作用等，充分利用菊苣根重量大，重点开发其药理价值，以菊苣根中黄酮的提取及其提取方法等，提取出的黄酮的营养价值及其药理特性等，使人民更好的利用其营养价值。2.5.2菊苣根总黄酮的研究意义目前菊苣根的应用已逐步成型，首先菊苣是一种具有发展前途的饲草作物。其生长迅速,再生性好,产草量高,年产鲜草每公顷150t以上；富含各种营养物质,以抽芽前营养价值最高,维生素、胡萝卜素、钙含量丰富。吸收率高,猪、鸡、鸭、鹅、兔、牛、鱼等皆喜食,据报道:用菊苣饲喂奶牛,每头奶牛每天采食菊苣45kg～50kg，10天后增产牛奶20%,奶质优良,口感醇香；饲喂猪,每2.54kg菊苣可替代1kg全价精料，用含有50%的菊苣饲料饲喂，肉料比为1∶3.93，猪毛色光亮，食欲旺盛，肉味甚佳。采用生物技术和利用酶制剂水解菊粉生产的低果聚糖，不经后处理，直接喷雾干燥制成粉剂，作为功能饲料添加剂，具有增殖双歧杆菌的作用，能够增强畜禽抗病害能力。菊苣的肉质根含有咖啡酸和奎宁酸所形成绿原酸和苦味质，经过焙炒可产生特殊的风味，能给浸煮液以深的色泽,增加咖啡的溶解质量，缓和咖啡的刺激作用,从而成为咖啡的添加物或代用品和制糖原料[22]，改善了咖啡的风味和浓度,提了咖啡的品质，同时还可减少木本咖啡的含量，降低成本。菊苣根中黄酮含量较高，具有清肝利胆、健胃消食、利尿消肿等功效[23]。菊苣由于营养丰富、口感鲜嫩,是一种极受欢迎的高档保健型蔬菜[24]。每100g鲜菊苣芽球中含K元素195.5mg、Zn元素0.793mg、胡萝卜素0.043mg、蛋白质680mg,维生素A、C和Mg等多种微量元素。另外菊苣在栽培过程中不需施药,是一种很好的优质高档保健型蔬菜,如今已在许多省份栽培,产品已投入市场,获得了较好效益。菊苣根中的黄酮具有通过益生元、益生菌调节肠胃蠕动功能，菊粉可作为肠道内有益菌双歧杆菌的增殖因子，刺激与促进双歧杆菌增殖，据报道菊粉已被国外开发成功能性食品，用来提高机体免疫力。其对细菌和真菌均有一定的抑制作用[25]。研究表明,大鼠膳食中加入5%～20%菊粉和低聚果糖,具有提高肠道钙吸收、调节钙平衡和骨矿密度的作用。菊苣提取物具有显著降低血清胆固醇,甘油三酯水平的药理活性。Vanen等对12名年龄在14～16岁的青少年测定了菊粉和低聚果糖对钙吸收的影响,结果表明：低聚果糖组钙吸收的百分率显著升高。通过多次老鼠试验已确认,菊苣低聚果糖可促进鼠类对无机盐的吸收,特别是对钙和镁的吸收。Coudray等以9名健康青年为研究对象,膳食中每天给予菊粉40g,实验28d,测定尿、粪中的钙、镁、铁和锌含量。结果显示：菊粉可显著增加钙吸收和钙平衡而不影响其它矿物质的储留。由于对菊苣低聚果糖消耗量的不同,可以使人对钙的吸收率分别提高26%～58%[26]。可开发作为促进矿物质吸收元素的食品，还具有降血脂、降低蛋黄总脂和胆固醇的作用[27]。菊苣植株茂盛,叶片深绿,花紫蓝色,花期长达4个多月,可以作为盆景花卉栽培,具有较高的观赏价值;菊苣根系发达,保水固土作用强,是优良绿化和水保植物；菊苣花还是优良的蜜源；菊苣的根、茎、叶是生产食用菌的优质基料。菊苣根中黄酮对人体有很多保健功效，菊苣叶可以食用，也可以做饲料用，而菊苣根并没有太大的工业应用，鉴于其黄酮的提取，可以进一步利用其根部提取物的营养价值。据报道北京奥运期间欧洲运动员要求食用菊苣，可见菊苣在欧洲非常有市场，作为农业大国，我国政府可以鼓励农民种植菊苣，把菊苣加工成成熟产品，出口国外，增加国民收入，菊苣的发展前景非常的客观。

第三章实验部分3.1实验样品菊苣根样品产地为河北承德。3.2实验仪器与试剂3.2.1实验仪器（1）JA2003N型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；（2）JJ-2型组织捣碎机（江苏金坛江南有限公司）；（3）DHG-914385-Ⅲ电热恒温鼓风干燥机（上海新苗医疗器械制造有限公司）；（4）UV1102型紫外分光光度计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；（5）FD-1C型冷冻干燥机（背景德天佑科技发展有限公司）；（6）TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；（7）SHZ-ⅢA型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；（8）85-2型恒温磁力搅拌器（郑州长城科贸有限公司）；（9）B-220型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；（10）RE52-98旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；（11）JPT-20架盘天平（江苏常热衡器厂）；（12）索氏提取装置；（13）凯氏烧瓶750ml；（14）电炉子（郑州长城科贸有限公司）；（15）容量瓶（100mL、500mL、1000mL、2000mL）若干；（16）锥形瓶250mL若干；（17）100mL具塞刻度量筒；3.2.2实验试剂（1）浓盐酸（分析纯）北京化工厂（2）冰醋酸（分析纯）北京化工厂（3）硫酸铜（分析纯）北京化工厂（4）高锰酸钾天津市化学试剂厂（5）芦丁北京化工厂（6）碳酸钠（分析纯）北京化工厂（7）95%乙醇（分析纯）北京化工厂（8）丙酮（分析纯）北京化工厂（9)无水乙醇（分析纯）北京化工厂（10）氢氧化钠沈阳试剂二厂（11)硝酸铝溶液（12)浓硫酸（分析纯）（13)硝酸钠溶液3.3实验方法3.3.1菊苣根中总黄酮提取工艺切片烘干（105℃）清洗切片烘干（105℃）清洗样品（根部）预处理 称重取样品品装瓶磨粉称重取样品品装瓶磨粉提取黄酮（超声波乙醇、乙醇回流提取）浸泡加入乙醇溶液提取黄酮（超声波乙醇、乙醇回流提取）浸泡加入乙醇溶液500nm下测OD值抽虑（得滤液）500nm下测OD值抽虑（得滤液）图3-1菊苣根中黄酮的提取工艺3.3.2菊苣根中总黄酮提取机理超声波乙醇提取机理超声提取的主要理论依据是超声的空化效应、热效应和机械作用。当大能量的超声波作用于介质时，介质被撕裂成许多小空穴，这些小空穴瞬时闭合，并产生高达几千个大气压的瞬间压力，即空化现象。超声空化中微小气泡的爆裂会产生极大的压力，使植物细胞壁及整个生物体的破裂在瞬间完成，缩短了破碎时间，同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，从而显著提高提取效率。乙醇回流提取机理应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装药材为容量的1／3－1／2，溶剂浸过药材表面1－2cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾约1小时。放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。3.3.3芦丁标准曲线(1)芦丁标准溶液配制准确称取经105℃（干燥至恒重）的芦丁标准品0.0150g，用无水甲醇溶液溶解并定容于100mL容量瓶中，将溶液摇匀，得浓度为1.5μg／mL的标准溶液备用[28]。(2)标准曲线的测定分别取上述芦丁标准溶液0.0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL，相当于芦丁含量分别为0μg、75μg、150μg、300μg、450μg、600μg，分别置于6个10.00mL刻度的比色管中，加入30％乙醇溶液至5mL处。分别加入5％亚硝酸钠溶液0．3mL，混合均匀，放置5min；加入10％硝酸铝溶液0．3mL混合均匀，放置6min后加入1mol/L氢氧化钠溶液2mL混匀，用30％乙醇定容至刻度，l0min后于502nm波长处做比色测定，参比为空白试剂。得芦丁浓度C与吸光度A的标准曲线及回归方程。（3）样品处理取样品1g（精确至0.01g）于25mL具塞比色管中，加入15mL无水乙醇，涡旋混匀3min，超声提取30min（超声条件60℃，功率100W），抽滤，用无水乙醇淋洗比色管残渣及抽滤瓶，收集全部滤液于100mL蒸发皿中，于50℃水浴上挥发除去乙醇，用无水甲醇冲洗蒸发皿，收集溶液于50mL容量瓶中，定容。（4）测定取1mL待测液于25mL比色管中，按测定标准曲线的步骤测定，加入30%乙醇5mL，加5%亚硝酸钠0.3mL，振荡后放置5min，加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀后放置6min，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液2mL，用30%乙醇定容至10mL，摇匀。同时另取同体积未加铝盐试剂的样液（补加水0.3mL），作为样品基体空白，与标准曲线比较确定总黄酮的含量。（5）结果计算样品中总黄酮含量（以芦丁计）按式计算X=（公式3-1）式中：X——样品中总黄酮含量（以芦丁计），单位为克每百克或克每百毫升（g/100g或g/100mL）；C——从标准曲线上查得的被测液中总黄酮含量，单位为微克（μg）；C0——从标准曲线上查得的被测液中样品基本空白含量，单位为微克（μg）；V2——样品定容体积，单位为毫升（mL）；V1——取待测液体积，单位为毫升（mL）；m——称取样品质量，单位为克（g）。3.3.4菊苣根中总黄酮提取方法超声波乙醇提取法（1）以温度来考察，分别设置为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃。准确称取样品粉末15g置于干燥锥形瓶中，加入70%乙醇溶液150mL，浸泡2h，将锥形瓶放入超声波清洗器中提取0.5h（功率100w），抽虑得滤液v1，把滤渣再加入相同溶度的乙醇溶液150mL，再次超声波提取0.5h，抽虑的滤液v2，合并v1v2，定容于500mL容量瓶中。（2）以乙醇浓度来考察，分别设置为50%、60%、70%、80%、95%。准确称取样品粉末15g置于干燥锥形瓶中，加入乙醇溶液150mL，浸泡2h，将锥形瓶放入超声波清洗器中提取0.5h（温度50℃，功率100w），抽虑得滤液v1，把滤渣再加入相同溶度的乙醇溶液150mL，再次超声波提取0.5h，抽虑的滤液v2，合并v1v2，定容于500mL容量瓶中。（3）以提取时间来考察，分别设置为0.5h、1.0h、1.5h、2.0h。准确称取样品粉末15g置于干燥锥形瓶中，加入70%乙醇溶液150mL，浸泡2h，将锥形瓶放入超声波清洗器中提取（温度50℃，功率100w），抽虑得滤液v1，把滤渣再加入相同溶度的乙醇溶液150mL，再次超声波提取，抽虑的滤液v2，合并v1v2，定容于500mL容量瓶中。（4）以料液比来考察，分别设置为1：10、1：15、1：20、1：25、1：30。准确称取样品粉末15g置于干燥锥形瓶中，加入70%乙醇溶液，浸泡2h，将锥形瓶放入超声波清洗器中提取1.0h（温度50℃，功率100w），抽虑得滤液v1，把滤渣再加入相同溶度的乙醇溶液，再次超声波提取1.0h，抽虑的滤液v2，合并v1v2，定容于500mL容量瓶中。乙醇回流提取法（1）以乙醇浓度来考察，分别设置为无水乙醇、95%、80%、70%、60%。准确称取样品15g，放于三角瓶中，加入浓度不同的乙醇溶液300mL，浸泡2h，放于恒温水浴锅中，在水浴温度为80℃下回流提取2.5h。抽虑，得到滤液。将滤液用与提取试剂相同的乙醇溶液定容于500mL容量瓶中。（2）以提取时间来考察，分别设置为2h、2.5h、3h、3.5h。准确称取样品15g，放于三角瓶中，浸泡2h，加入70%乙醇溶液300mL，放于恒温水浴锅中，在水浴温度为80℃下回流提取。抽虑，得到滤液。将滤液用与提取试剂相同的乙醇溶液定容于500mL容量瓶中。（3）以提取温度来考察，分别设置为75℃、80℃、85℃、90℃。准确称取样品15g，放于三角瓶中，浸泡2h，加入70%乙醇溶液300mL，放于恒温水浴锅中，在水浴温度下回流提取2.5h。抽虑，得到滤液。将滤液用与提取试剂相同的乙醇溶液定容于500mL容量瓶中。（4）以料液比来考察，分别设置为1：10、1：15、1：20、1：25、1：30。准确称取样品15g，放于三角瓶中，浸泡2h，加入70%乙醇溶液，放于恒温水浴锅中，在水浴温度为80℃下回流提取2.5h。抽虑，得到滤液。将滤液用与提取试剂相同的乙醇溶液定容于500mL容量瓶中。在单因素试验的基础上，选取四个主要影响因素：乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度，进行L9(34)正交试验，因素水平见表3-2，以黄酮含量为指标，确定最佳提取工艺。表3-1正交因素表水平因素A液料比（V/M）B提取时间（h）C乙醇浓度（%）D提取温度（℃）1152.080752202.570803253.060853.3.5总黄酮的测定—分光光度法（1）准确吸取提取液0.5mL于25.00mL比色管中。（2）用85%的乙醇稀释到10.00mL处，加入5%Na2No3溶液0.8mL，混合均匀，放置10min；加入10%Al(NO3)3溶液0.8mL，混合均匀，放置10min；再加入4%NaoH溶液10.00mL，混合均匀，放置10min；加入85%乙醇溶液至刻度，混合均匀，放置10min后。（3）将其放置于500nm处，测其吸光度。第四章结果与讨论4.1芦丁标准曲线的绘制表4—1芦丁标准曲线样品芦丁质量（g）芦丁标准溶液体积（mg）吸光度平均吸光度01号000000.0242号0.050.50.0210.0230.0210.0453号0.101.00.0430.0430.0410.0814号0.202.00.0800.0810.0820.1195号0.303.00.1230.1210.1200.159图4-1芦丁标准曲线图4—1中，回归方程为y=0.3889x+0.0026，其R2值为0.9996，证明标准曲线线性回归良好。表明芦丁标准品的浓度在0～1.0mg/mL的范围内与吸光度值有良好的线性关系。4.2菊苣根中总黄酮提取结果4.2.1超声波乙醇提取结果（1）以温度来考察，得：表4—2（超声波法）温度对黄酮含量的影响温度（℃）2030405060吸光度0.0210.0280.0340.0400.031黄酮含量(mg/g)3.184.365.386.394.87图4—2（超声波法）温度对黄酮含量的影响在50℃时提取会使黄酮含量最高，黄酮在乙醇中的溶解度随着温度的升高而增大，温度升高，浸提液黏度减少，扩散系数增加，促进浸提速度，但温度过高会使黄酮氧化，使黄酮含量降低。（2）以乙醇浓度来考察，得：表4—3（超声波法）乙醇浓度对黄酮含量的影响乙醇浓度50%60%70%80%95%吸光度0.0290.0320.0400.0350.028黄酮含(mg/g)4.535.046.395.554.36图4—3（超声波法）乙醇浓度对黄酮含量的影响70%乙醇浓度是黄酮含量最高，低于会使黄酮得不到充分的溶解，高于会把叶绿素的其它物质浸提出来，这些物质会对分光光度法测黄酮含量有影响。以提取时间来考察，得：表4—4（超声波法）提取时间对黄酮含量的影响提取时间（h）0.51.01.52.0吸光度0.0310.0400.0330.029黄酮含量(mg/g)4.876.395.214.53图4—4（超声波法）提取时间对黄酮含量的影响当提取时间为1.0h时黄酮含量最高，时间低于1.0h使黄酮得不到充分的溶解，当超过1.0h，会使部分乙醇挥发而导致沸点逐渐增大，从而破坏黄酮的含量。以物料比来考察，得：表4—5（超声波法）料液比对黄酮含量的影响料液比1：101：151：201：251：30吸光度0.0290.0400.0340.0300.026黄酮含(mg/g)4.536.395.385.314.54图4—5（超声波法）料液比对黄酮含量的影响料液比为1：15时得黄酮含量最高。低于会使样品中黄酮得不到充分的溶解，使含量小，物料比的增大不会使黄酮含量增大，反而不利于乙醇的浓缩工艺。4.2.2乙醇回流提取结果（1）以乙醇浓度来考察，得：表4—6（热回流法）乙醇浓度对黄酮含量的影响乙醇浓度无水乙醇95%80%70%60%吸光度0.0160.0200.0340.0480.032黄酮含(mg/g)2.333.015.387.745.03图4—6（热回流法）乙醇浓度对黄酮含量的影响70%的乙醇浓度使菊苣根中黄酮含量最高。低于70%会使黄酮得不到充分的溶解，高于会把叶绿素的其它物质浸提出来，叶绿素等物质会对紫外线吸收有干扰，影响黄酮含量。（2）以提取时间来考察，得：表4—7（热回流法）提取时间对黄酮含量的影响提取时间(h）2.02.53.03.5吸光度0.0390.0480.0420.030黄酮含量(mg/g)6.227.746.735.31图4—7（热回流法）提取时间对黄酮含量的影响当提取时间为2.5h时黄酮含量最高，时间低于2.5h使黄酮得不到充分的溶解，当超过2.5h，会使部分乙醇挥发而导致沸点逐渐增大，从而破坏黄酮的含量。（3）以温度来考察,得：表4—8（热回流法）温度对黄酮含量的影响温度(℃)75808590吸光度0.0410.0480.0360.031黄酮含量(mg/g)6.567.745.724.87图4—8（热回流法）温度对黄酮含量的影响80℃黄酮含量最高。黄酮在乙醇中的溶解度随着温度的升高而增大，温度升高，浸提液黏度减少，扩散系数增加，促进浸提速度，但温度过高会使黄酮氧化，黄酮含量降低。（4）以物料比来考察，得：表4—9（热回流法）料液比对黄酮含量的影响料液比1：101：151：201：251：30吸光度0.0260.0340.0480.0400.032黄酮含量（mg/g)4.545.387.746.405.03图4—9（热回流法）料液比对黄酮含量的影响料液比为1：20时得黄酮含量最高。低于会使样品中黄酮得不到充分的溶解，使含量小，物料比的增大不会使黄酮含量增大，反而不利于乙醇的浓缩工艺。4.3菊苣根中总黄酮提取方法总结通过对超声波乙醇提取法和乙醇回流提取法的单因素方法的优化比较得到：乙醇回流提取法得到的的黄酮含量较高，且其方法简单，故对其进行正交实验，结果如表4—11：表4—11正交试验结果表试验号因素黄酮含量(mg/g)ABCD液料比提取时间乙醇浓度提取温度111115.72212226.73313335.38421237.07522316.90623127.24731326.73832136.56933216.90均值16.946.516.516.51均值27.076.736.906.90均值36.736.516.346.32R60.58较优水平A2B2C2D2逐次因数D>C>B>A经分析可知，对黄酮含量影响最大的是提取温度和乙醇浓度，其次是提取时间、液料比。最佳的提取工艺为：乙醇浓度70％，提取温度80℃，提取时间2.5h，料液比为1：20，提取次数3次。对选定的最佳工艺条件进行重复实验，获得的黄酮含量为7.74mg/g。第五章结论与展望5.1结论用单因素的实验方法，通过改变实提取温度、提取时间、乙醇浓度、物料比实验因素，获得的提取液在紫外分光光度下测其吸光度，即获得菊苣根中黄酮的含量。通过超声波乙醇提取法、乙醇回流提取法的比较，得到乙醇回流提取法较适合菊苣根中黄酮的提取，所以用乙醇回流提取的方法提取黄酮，得到提取黄酮的最优条件为：提取温度：80℃、乙醇浓度：70%、提取时间：2.5h、料液比：1：20，在最优条件下得到黄酮含量最高为7.74mg/g。在用乙醇回流提取的单因素方法之后，做正交实验，得到菊苣根中黄酮的含量，得到结果：提取温度对菊苣根中黄酮含量影响最大，次之是乙醇浓度、提取时间，料液比影响最小。5.2展望应尽快引进国外的先进的菊苣加工技术，利用科研上的成功试验，将各种研究成果变成现实，提高人民的收入。由于菊苣是优良的高产的绿色的作物，政府应加大宣传力度，鼓励农民种植菊苣，加工菊苣，使菊苣产品成为中国创造，而非