层析和膜技术在生物制药中的应用

层析和膜技术在生物制药中的应用层析和膜技术在生物制药中的应用第1页一.离子交换层析技术定义：利用溶液中各种带电颗粒与离子交换剂之间结协力差异进行物质分离操作称离子交换法。离子交换剂由惰性不溶性载体，功效基团和平衡离子组成。平衡离子带正电荷为阳离子交换剂，平衡离子带负电荷为阴离子交换剂，可见离子交换剂是一类含有活性基团荷电固相颗粒。层析和膜技术在生物制药中的应用第2页离子交换层析技术离子交换反应：离子交换剂与交换离子间作用是由静电引力而产生，是一个可逆反应过程，当这个反应到达动态平衡时，其平衡点伴随pH、温度、溶剂组成及交换剂本身性质改变而改变。比如，向平衡体系中加入过量X+离子，反应倾向于生成R-SO3-X+。层析和膜技术在生物制药中的应用第3页离子交换层析技术

因为待分离溶质分子带有不一样性质电荷和不一样电荷量，因而在作为固定相离子交换剂和流动相洗脱液之间发生可逆交换作用，并经过调整pH值、或改变同性离子浓度等方法，使溶质分子移动速度发生改变，从而到达分离目标。层析和膜技术在生物制药中的应用第4页

离子交换层析应用如庆大霉素，小诺霉素提炼，应用了离子交换技术。

层析和膜技术在生物制药中的应用第5页庆大霉素提炼

酸化目标在于将庆大霉素从菌丝体中释放出来，然后为了便于离子交换，将酸化液中和，再于中性溶液中投入732强酸性阳离子树脂。因为庆大霉素属于碱性抗生素，系有机碱，能与各种酸成盐，在水溶液中以离子状态G+存在，能够为阳离子树脂所吸附，对吸附了庆大霉素732树脂进行洗涤，先用稀酸洗至无Ca2+、Mg2+，接着用无盐水洗至无Cl-，然后用稀氨洗去小组分杂质，最终用浓氨进行洗脱，洗脱液（解吸液）用711阴离子树脂进行脱色，然后经浓缩，转盐、活性炭脱色，喷雾干燥即得庆大霉素成品。

层析和膜技术在生物制药中的应用第6页层析和膜技术在生物制药中的应用第7页

离子交换层析应用

粗卵蛋白分级分离

卵蛋白中：主要有卵清蛋白54-57%（pI4.5)；蓝清蛋白12-15%（pI6.1)；卵粘蛋白3-4%(pI4.7)。卵白过滤，用polybuffer74稀释，离心，上PBE94柱，以0.025mol/L咪唑-HCl(pH7.2)平衡，用1:10polybuffer74洗脱，分辨率良好。层析和膜技术在生物制药中的应用第8页二.凝胶层析凝胶层析，是指样品混合物经过一定孔经凝胶固定相，因为流经体积差异，使不一样分子量组分得以分离一个分离技术。因整个层析过程与过滤相同也称凝胶过滤。又因为物质在分离过程中阻滞减速现象，也称排阻层析。或称凝胶扩散层析。凝胶每个颗粒细微结构如同一个筛子，小分子能够进入凝胶网孔，大分子被排阻于凝胶颗粒之外，因而也称分子筛层析。层析和膜技术在生物制药中的应用第9页凝胶层析分离原理

分子筛理论最轻易了解，当含有大小分子混合物品流给凝胶层析柱时，各组分随洗脱液流动而移动.大分子进入不了颗粒内部，最先流出；中分子个别地进入颗粒，流出速度中等；小分子进入全部颗粒内部，移动速度慢，最终流出。整个样品接分子量大小次序先后流出层析柱，从而到达分离。层析和膜技术在生物制药中的应用第10页凝胶层析分离原理层析和膜技术在生物制药中的应用第11页凝胶层析分离原理当将含有三种不一样分子量物质混合样品用某种规格凝胶柱进行分离，然后以洗脱体积为横坐标，各物质浓度为纵座标，即得下列图洗脱曲线。

层析和膜技术在生物制药中的应用第12页凝胶层析应用凝胶层析目标（或称分离形式）普通有二种：分组分离和分级分离。分组分离亦称类分离，其目标是将分子量极为悬殊两类物质分开，如蛋白质与盐分离,常见SephadexG-25，因为其分离范围是1,000-5,000，被分离两组物质分子量恰好落在分离范围两侧，大分子组为全排阻，而小分子组为全渗透，其Kd值差可达最大值1。层析和膜技术在生物制药中的应用第13页凝胶层析应用分级分离，将分子量相差不很大大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白。对于这种分子量相近物质分离经常选取排阻限略大于样品中最高分子量凝胶，即O≤Kd≤1。假如样品中含有3个组分话，最好一个靠近全排阻，另一个靠近全渗透，第三个为个别渗透，且分子量大于渗透限3倍，并小于排阻限1/3。层析和膜技术在生物制药中的应用第14页凝胶层析应用脱盐浓缩去热原分子量测定纯化层析和膜技术在生物制药中的应用第15页凝胶层析应用:脱盐和浓缩脱盐和浓缩属类分离，选择凝胶使大分子组为全排阻，小分子组为全渗透（Kd=1）。脱盐用凝胶多用大粒度、高交联度凝胶。∵交联度大，凝胶颗粒强度很好；粒度大，柱层操作比较便利，流速也高。洗脱多为易挥发盐缓冲溶液；∵用水洗脱时，有些蛋白质脱盐后溶解度下降，造成被凝胶粒吸附甚至以沉淀状态析出。样品体积最好小于内水体积三分之一，方便得到理想脱盐效果。层析和膜技术在生物制药中的应用第16页凝胶层析应用:脱盐和浓缩

方法：柱层析包埋法样品置于透析袋中埋入干胶颗粒堆内，经过相当初间后，样品中盐与水分一道为干胶所吸收。直接投入法即将一定量干胶投入盛样品容器或直接使样品溶液从干胶柱上流下。

层析和膜技术在生物制药中的应用第17页凝胶层析应用:分离纯化用SephadexG-50纯化牛、猪胰岛素:层析和膜技术在生物制药中的应用第18页用SephadexG-25分离氨基酸混合物层析和膜技术在生物制药中的应用第19页用SephadexG-25分离氨基酸混合物用葡聚糖凝胶分离多组分混合物，除利用分子筛效应外，还可利用一些物质与凝胶含有程度不等弱吸附作用。如图7.31，用SephadexG-25分离氨基酸混合物，各个氨基酸流出先后次序并不是按分子量大小次序，而是按照吸附作用强弱次序，其中二个酸性氨基酸，谷氨酸（pI3.22），甘氨酸（pI5.97）先被流出，而pI分别为5.48和5.66苯丙氨酸，酪氨酸，因为是苯环化合物，存在弱吸附故后被流出，而色氨酸是杂环合物，碱性氨基酸，吸附最强，所以最终流出.层析和膜技术在生物制药中的应用第20页凝胶层析应用分子量测定测定依据：不一样分子量物质，只要在凝胶分离范围内（渗透限与排阻限之间），其洗脱体积Ve及分配系数Kd值随分子量增加而下降。待测物质洗脱体积与分子量关系符合下式：Ve=-KlogM+CK、C是常数，为直线方程斜率和外推截距。同时Kav=-K′logM+C层析和膜技术在生物制药中的应用第21页凝胶层析应用测定分子量方法：标准曲线法。先以3个以上已知分子量标准蛋白（有标准蛋白商品出售）过柱，测取各目Ve值，以Ve做纵坐标，logM做横坐标制作标准曲线，之后在同一测定系统测取未知物质Ve值，即可由标准曲线求得分子量。注意：测得分子量是近似分子量，误差在±10%。该法操作简便，需要样品量较少，实用价值较大。层析和膜技术在生物制药中的应用第22页凝胶层析应用:分子量测定层析和膜技术在生物制药中的应用第23页三.亲和层析大家发觉生物体中许多高分子化合物含有和一些相对应专一分子可逆结合特征，比如酶与底物、抗原与抗体、激素与受体、核糖核酸与其互补脱氧核糖核酸，多糖与蛋白复合体等，都含有这种特征。生物分子间这种结合能力称为亲和力，依据生物分子特异亲和力而设计层析技术称为亲和层析，在亲和层析中起可逆结合特异性物质称为配基，与配基结合层析介质称为载体。层析和膜技术在生物制药中的应用第24页亲和层析设计原理和过程:

层析和膜技术在生物制药中的应用第25页3.亲和层析应用因为亲和层析技术含有简便，快速、专一和高效等特点，应用十分广泛，已普及到生命科学各个领域。应用范围以下：（1）提取、分离纯化、浓缩各类生物分子；（2）分离纯化各种功效细胞，细胞器，膜片段和病毒颗粒；（3）用于各种生化成份分析检测；（4）其它；层析和膜技术在生物制药中的应用第26页3.亲和层析应用最大优点：利用它从粗提液中经过一次简单处理便可得到所需高纯度活性物质。比如分离胰岛素受体时，把胰岛素作为配基，偶联于琼脂载体上，经亲和层析，从肝脏匀浆中提取胰岛素受体，纯化达8000倍。层析和膜技术在生物制药中的应用第27页金属螯合亲和层析

原理：蛋白质分子能够与金属离子发生亲和反应，并与之结合，可用于吸附纯化蛋白质。蛋白质表面氨基酸残基，如组氨酸咪唑基团、半胱氨酸巯基、色氨酸吲哚基团，可提供电子，与金属离子结合，从而发生亲和层析。配基与生物大分子结合机理包含范德华力、疏水键、静电以及金属螯合作用。

层析和膜技术在生物制药中的应用第28页金属螯合亲和层析柱制备：

将环氧活化型Sepharose6B与金属螯合剂（如亚氨二醋酸）偶联成配基，再用金属离子溶液处理（如Zn2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Cd2+），即成。

层析和膜技术在生物制药中的应用第29页金属螯合亲和层析

上样：柱子经平衡后，可将含有生物活性物质样品上柱，与固定化金属配基复合物有亲和力分子都将被滞留，其余则流出柱外。洗脱：可经过改变盐浓度、改变pH、或由竞争性试剂将蛋白质置换下来，这些方式机理都是经过降低固定化金属离子和蛋白质之间亲和常数。层析和膜技术在生物制药中的应用第30页金属螯合亲和层析应用:

利用含汞树脂分离谷胱甘肽

谷胱甘肽中半胱氨酸含有巯基，巯基化合物与汞含有很强化学亲和作用，所以用含汞树脂提取含巯基化合物能取得很好效果。谷胱甘肽多从酵母中提取，也可从啤酒生产废酵母中提取。酵母提取液中除了含谷胱甘肽外，还含有其它含巯基氨基酸和短肽，含汞树脂对这些物质也有一定吸附。可经过调整酵母提取液pH值，改变树脂对各种杂质成份吸附力，以到达分离目标。层析和膜技术在生物制药中的应用第31页有机染料亲和层析

基础原理：一些有机染料如蒽醌化合物和偶氮化合物含有类似于NAD+结构，所以一些需要核苷酸类物质为辅酶酶，对这些染料有一定亲和力，假如这些染料作为配基共价偶联到纤维素或琼脂糖等多糖载体上，就能制得染料亲和层析柱。常见有机染料有二羟偶氮复合物。有机染料亲和层析已成功地分离纯化了各种酶，以及应用于白蛋白、脂蛋白和干扰素等分离。层析和膜技术在生物制药中的应用第32页有机染料亲和层析应用：

苯丙氨酸脱氢酶纯化

苯丙氨酸脱氢酶纯化应用了有机染料亲和层析法。将一个模拟生物染料配基（商品名：ProcionRedHE-3B）,结合在SepharoseCL-4B上。ProcionRedHE-3B与依靠NAD/NADH作辅酶酶有特异性结合，因而在分离这种类型酶时，应用很广。层析和膜技术在生物制药中的应用第33页有机染料亲和层析应用：

苯丙氨酸脱氢酶纯化将含有苯丙氨酸脱氢酶酶提取液上柱，亲和柱专一性地吸附苯丙氨酸脱氢酶。然后，用平衡缓冲液洗去杂蛋白，再用1mmol/L

NADH（配于平衡缓冲液中）将酶洗脱下来。经过这种方法纯化酶，纯度到达单一区带，到达了诊疗用酶制剂纯度要求。苯丙氨酸脱氢酶可作为诊疗试剂，用于测定和监测遗传性代谢疾病苯丙酮酸尿。作为诊疗用酶制剂市场很大。层析和膜技术在生物制药中的应用第34页四.膜分离技术膜分离概念：利用膜选择性（孔径大小），以膜两侧存在能量差作为推进力，因为溶液中各组分透过膜迁移率不一样而实现分离一个技术。层析和膜技术在生物制药中的应用第35页透析技术

透析是应用得最早膜分离技术。透析法特点,是用于分离两类分子量差异较大物质。即将分子量103级以上大分子物质与分子量在103级以下小分子物质分离，属于分子水平分离，无相改变。透析法都是在常压下依靠小分子物质扩散运动来到达分离浓缩目标。此点不一样于超滤。层析和膜技术在生物制药中的应用第36页透析技术优点：简便，不需要复杂装置。缺点：速度慢、处理量小。用途：（1）透析法多用于去除大分子溶液中小分子物质，称为脱盐；（2）常见来对溶液中小分子成份进行迟缓改变。即所谓透析平衡，如浓缩大分子、透析结晶等。层析和膜技术在生物制药中的应用第37页旋转透析装置层析和膜技术在生物制药中的应用第38页连续透析器层析和膜技术在生物制药中的应用第39页平面透析器用塑料框把透析管张开成为很薄平面透析管，使透析面积增大，提升了效率。

浅流透析器可兼用于透析和超滤。层析和膜技术在生物制药中的应用第40页超滤技术超滤技术是近几十年快速发展起来一项分子级薄膜分离伎俩，它以特殊超滤膜为分离介质，以膜两侧压力差为推进力将不一样分子量物质进行选择性分离。超滤膜最小截留分子量为500道尔顿，在生物制药中可用来分离蛋白质、酶、核酸、多糖、多肽、抗生素、病毒等。层析和膜技术在生物制药中的应用第41页超滤技术优点：没有相转移，无需添加任何化学物质，能够在低温下操作，过滤速度较快，便于做无菌处理，分离操作简便，防止生物活性物质活力损失和变性。用途：①大分子物质脱盐和浓缩；②小分子物质纯化；③大分子物质分级分离；④生化制剂或其它制剂去热原处理。层析和膜技术在生物制药中的应用第42页超滤技术应用浓缩和脱盐优点是不消耗试剂，无相转移，可在低温下进行，浓缩同时还可脱掉盐和其它小分子杂质。脱盐方法：

（1）稀释超滤法盐离子等小分子杂质随溶剂（水）不停透过滤膜而去，当浓缩到一定浓度时再加入溶剂至原体积，如此重复屡次，绝大个别小分子物质可被除去。（2）渗滤法脱盐原理与稀释法相同。层析和膜技术在生物制药中的应用第43页

超滤应用分级分离与纯化如右图所表示，按分子量截留值由大而小串联几个超滤器，各自保持一定体积，用10-20倍体积缓冲液逐层洗下，不一样分子量物质对应下移，在各滤器中取得不一样分子量范围组分，从而使大分子量得到分离和纯化，同时也进行了浓缩。层析和膜技术在生物制药中的应用第44页超滤应用除菌超滤是一个很好冷灭菌法，适合于不能高压消毒灭菌生化产品；去热原适合一些分子量较小生物药品去热原；层析和膜技术在生物制药中