血清蛋白质浓定量测定

血清蛋白质浓定量测定第1页/共31页BCA法是近来广为应用的蛋白定量方法。操作简便，快速，灵敏度高，准确，试剂稳定性好，经济实用，抗干扰能力强第2页/共31页第3页/共31页【原理】：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

第4页/共31页第5页/共31页【原理】：第6页/共31页基本原理BCA(bicinchoninicacid)法蛋白浓度定量：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+（biuretreaction）。BCA与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。第7页/共31页【试剂】1、试剂A：分别称取10gBCA二钠盐、20g无水碳酸钠、0.16g酒石酸钠、4g氢氧化钠、9.5g碳酸氢钠，混合调PH值至11.25，加水至1L。2、试剂B：4％硫酸铜。3、BCA工作液：试剂A100ml＋试剂B2ml混合。第8页/共31页操作步骤1.先将solutionA摇晃混匀，根据样品数量，按50体积solutionA加1体积solutionB试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液在24小时内稳定。

第9页/共31页2、蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白(BSA)根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定）第10页/共31页

3.绘制标准曲线：

取6支试管，编号后分别加入0mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL标准蛋白质溶液(BSA)，然后各管分别用去离子水补充到0.1mL，最后各试管中分别加入2.0mLBCA工作液，每加完一管，立即在漩涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除），以蛋白质的蛋白含量为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。第11页/共31页第12页/共31页第13页/共31页4.样品测定：同绘制标准曲线方法，在一支试管中加入待测样品0.1mL代替标准蛋白质溶液，然后加入2.0mLBCA工作液后，立即在漩涡混合器上混合，测吸光度A，查标准曲线，求出待测样品中蛋白质浓度（g/L）。第14页/共31页【优缺点】(一)操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便；(二)准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。(三)经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；(四)抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响第15页/共31页此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。第16页/共31页

BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCAProteinAssayKit)是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。检测浓度下限达到25微克/毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，待测样品体积为1～20微升。第17页/共31页试剂盒组成第18页/共31页2.稀释标准品：完全溶解蛋白质标准品（5mg/mlBSA(牛血清白蛋白),-20℃保存）取10微升用PBS(pH7.4的等渗磷酸盐缓冲液)稀释至100微升（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将稀释后的标准品（0.5mg/ml）按0,2,4，6，8,12,16,20微升分別加到96孔板的蛋白标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升。

体积(ul)02468121620终浓度（ug/ul)00.050.10.150.20.30.40.5第19页/共31页pH7.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）的配制pH7.4的等渗磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.4,PBS）:NaCI

8.0gKH2PO4

0.2gNa2HPO4·12H2O

2.9gKCI

0.2g将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量蒸馏水溶解后，再定容至1000mL，调pH值至7.4,高压消毒灭菌112Kpa20min，冷却后，保存于4℃冰箱中备用。第20页/共31页第21页/共31页6孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml,12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml,24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml,96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml,摘自司徒镇强的《细胞培养》第22页/共31页实验步骤第23页/共31页实验步骤第24页/共31页3、待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。第25页/共31页【试剂】1、试剂A：1％BCA二钠盐2％无水碳酸钠0.16%酒石酸钠0.4％氢氧化钠0.95％碳酸氢钠混合调PH值至11.25。2、试剂B：4％硫酸铜。3、BCA工作液：试剂A100ml＋试剂B2ml混合。4、蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定）5、待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。第26页/共31页实验步骤第27页/共31页

加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液不足道20ul。即：将蛋白质样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释第28页/共31页4.

各孔加入200微升BCA工作液，用加样枪轻轻吹打混匀（注意：不要弄出气泡影响读数），37℃放置30-60分钟。冷却到室温后，用酶标仪测定A562nm，或540-590nm之间的其他波长的吸光度，根据标