多克隆抗体的制备专家讲座

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陈伟伟多克隆抗体制备及

抗体活性测定多克隆抗体的制备专家讲座第1页主要内容多克隆抗体制备基本原理多克隆抗体制备操作步骤抗体活性试验原理、操作流程和结果判断多克隆抗体的制备专家讲座第2页原理1、克隆(clone)：是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成一簇细胞系。在这个家族全部组员中，如无发生突变其基因是完全相同。2、多克隆抗体（polyclonalantibody,pAb）：用一个包含各种抗原决定簇抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对各种抗原表位不一样抗体。所取得免疫血清实际上是含有各种抗体混合物，即多克隆抗体。3、单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAb）：由一个识别一个抗原表位B细胞克隆产生同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。多克隆抗体的制备专家讲座第3页第一代抗体是传统抗体制备方法即利用抗原免疫动物后取得抗体，称为多克隆抗体（polyclonalantibody）；第二代抗体是经过杂交瘤技术制备出针反抗原中某一抗原决定簇抗体称为单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)；第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(geneticengineeringantibody)。抗体发展历史多克隆抗体的制备专家讲座第4页

多克隆抗体制备流程免疫原制备免疫动物免疫血清搜集免疫血清判定免疫血清保留多克隆抗体的制备专家讲座第5页

免疫原（immunogen）：

指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞抗原最主要性质是免疫原性（immunogenicity）.免疫原种类：天然抗原、人工合成抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原。

免疫原制备多克隆抗体的制备专家讲座第6页

细胞性抗原制备：绵羊红细胞（SRBC）-溶血素；细菌-抗菌抗体（动物免疫血清）。

可溶性抗原制备：指蛋白质、多糖和脂类等。多克隆抗体的制备专家讲座第7页细胞破碎重复冻融法超声破碎法自溶法酶处理法表面活性剂处理法多克隆抗体的制备专家讲座第8页

超速离心分离：

是一个依据分离物质比重特点，经过差速或梯度密度离心，将分子大小不一样抗原颗粒分开方法，只适宜少数大分子物质分离。

选择性沉淀：

选择某抗原理化特征，采取对应沉淀剂或溶液环境，如：

核酸去除

盐析沉淀法有机溶剂沉淀法高分子聚合物沉淀法

50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；8%～12%PEG6000可沉淀IgG。粗分离多克隆抗体的制备专家讲座第9页

超滤法：

利用孔径大小不一样特制薄膜对不一样分子大小抗原物质进行滤筛。

电泳多克隆抗体的制备专家讲座第10页精分离

层析法：

凝胶过滤层析离子交换层析

亲和层析

疏水层析

反相层析多克隆抗体的制备专家讲座第11页判定纯化蛋白含量、相对分子质量、纯度以及免疫学活性。蛋白含量—凯氏定氮（紫外光280nm等），Lowry分子质量—电泳、质谱蛋白纯度—电泳、HPLC免疫原性—免疫印迹、免疫双扩散、免疫组化蛋白活性—ELISA、XTT蛋白结构—红外光谱、氨基酸测序蛋白等电点—IEF蛋白判定多克隆抗体的制备专家讲座第12页免疫佐剂

一些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原特异性免疫应答或改变免疫应答类型，这类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。多克隆抗体的制备专家讲座第13页佐剂种类佐剂普通包含以下几类：

无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等；

生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；

人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（polyI：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（polyA：U）；油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；

纳米佐剂多克隆抗体的制备专家讲座第14页弗氏佐剂（Freund’sadjuvant）分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种：前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐温-80）按1：1～1：5百分比混合而成；后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水”乳化液。多克隆抗体的制备专家讲座第15页

佐剂与抗原混合乳化方法：

研磨法搅拌混正当多克隆抗体的制备专家讲座第16页

佐剂免疫生物学作用增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性物质变成持久或强免疫原；增强机体反抗原刺激反应性，提升首次应答和再次应答所产生抗体滴度；改变抗体类型，使产生抗体由IgM型转变为IgG型；引发或增强迟发性超敏反应。多克隆抗体的制备专家讲座第17页佐剂作用机制佐剂作用机制归纳起来主要有以下几个：可增强抗原表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原免疫原性。佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织滞留时间，有利于抗原迟缓释放。增强吞噬细胞吞噬作用（被佐剂吸附抗原易被吞噬细胞吞噬），促进反抗原处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答效应。多克隆抗体的制备专家讲座第18页动物免疫免疫动物选择：

抗原起源与动物种属关系：抗原起源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。动物个体选择：适龄、健康、体重符合要求正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选取家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选取绵羊、山羊、马、驴等大动物。多克隆抗体的制备专家讲座第19页

免疫方法

选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫路径、免疫次数、免疫间隔等原因。免疫原剂量：免疫原接种剂量按免疫原性强弱、动物个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。

免疫路径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不一样免疫方案而异。对于不易获取宝贵抗原可采取淋巴结免疫法。免疫间隔时间是影响抗体产生主要原因，其中首次与第二次免疫间隔时间尤为主要，普通以10～20天为佳，二次后间隔时间普通为7～10天，若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。多克隆抗体的制备专家讲座第20页动物采血采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价到达要求，应在末次免疫后一周及时采血，不然抗体效价会下降。

颈动脉采血法心脏采血法静脉采血法多克隆抗体的制备专家讲座第21页免疫血清判定

表示量测定：颗粒性抗原可采取凝集试验，可溶性抗原惯用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。

玻片凝集试验肥达试验（微量法）ELISA多克隆抗体的制备专家讲座第22页玻片凝集试验

玻片凝集试验为定性试验方法，普通用已知抗体作为诊疗血清、与受检颗粒抗原如菌液或红细胞悬液各加1滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现颗粒凝集为阳性反应。此法简便、快速，普通用来判定菌种或分型，也用于人类ABO血型判定。

多克隆抗体的制备专家讲座第23页肥达试验（Widaltest）是用已知伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原与病人血清做定量凝集试验，以测定患者血清中有没有对应抗体，依据抗体含量多少以及增加情况判断阳性。此法普通用来帮助诊疗伤寒及副伤寒。

肥达试验多克隆抗体的制备专家讲座第24页ELISA酶联免疫吸附试验(ELISA)即将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标识抗原抗体反应在固相表面进行技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，含有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。多克隆抗体的制备专家讲座第25页

特异性判定：抗体特异性判定惯用双向免疫扩散法、免疫电泳法。

纯度判定：抗体纯度判定可采取SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS）、双向扩散试验、免疫电泳等方法。

IgG含有重链和轻链，纯IgGSDS结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备抗体混有杂蛋白，需深入纯化。

结合活性判定：测定抗体亲力方法较多，如平衡透析法、ELISA或RIA竞争结合试验等。多克隆抗体的制备专家讲座第26页抗体亲合常数测定亲合常数测定采取非竞争酶免疫试验法：先确定在某一抗原浓度时抗体能够到达饱和；以该抗原浓度为试验条件，饱和时OD值作为OD-100，找出OD-50时抗体浓度和对应抗原浓度；依据公式Ka=n-1计算抗体Ka值。

2(n[Ab’]t-[Ab]t)t代表测定时温度；n=[Ab]t/[Ab’]t；[Ab]t表示抗原浓度较高Amax二分之一；[Ab’]t表示抗原浓度较低Amax二分之一。对于单克隆抗体，普通亲协力要求>107L/mol，好单抗多大于109L/mol。多克隆抗体的制备专家讲座第27页多克隆抗体保留

4℃保留（6个月）低温保留（-70℃～-20℃，5年）真空干燥保留（5～10年）注意点：保留前需经除菌保留液含防腐剂防止重复冻融（分装）

多克隆抗体的制备专家讲座第28页半抗原性免疫原制备载体选择：（1）蛋白质类：惯用有些人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为惯用。（2）多肽类聚合物：是由人工合成多肽聚合物，也是一类良好载体，惯用有多聚赖氨酸。（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱导动物产生良好抗体。多克隆抗体的制备专家讲座第29页

连接方法：

物理法：是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是经过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有PVP和CMC等；化学法：是利用一些功效基团把半抗原连接到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不一样半抗原应选取不一样方法进行连接。多克隆抗体的制备专家讲座第30页

依据化学基团不一样，连接方法主要有以下几类：带游离氨基或羧基以及二种基团皆有半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定肽键，带氨基半抗标准可与载体羧基缩合。带有羟基、酮基、醛基半抗原：不能直接与载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O-羧甲基、羟胺法等方法将之转变为带有羧基半抗原衍生物后才能与载体连接。带有酚基半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化对氨基苯甲酸法，生成带有羧基半抗原衍生物。多克隆抗体的制备专家讲座第31页谢谢请提出您宝贵意见！多克隆抗体的制备专家讲座第32页Ab1Ab3Ab4单克隆抗体抗原Ab1抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清